TRANSFERENCIA DE ENERGÍA NO FLUORESCENTE.

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y bioquímica molecular.En determinadas realizaciones, se proporcionan reactivos y ensayos que implica la transferencia de energía no fluorescente. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las técnicas de obtención de información sobre moléculas biológicas, tales como ácidos nucleicos y proteínas, se aplican en muchas disciplinas diferentes, entre llas diversas ramas de la ciencia médica. Muchas de estas técnicas incluyen la utilización de marcajes fluorescentes para generar señales detectables. Por ejemplo, una clase de pigmentos fluorescentes que se ha desarrollado incluye pigmentos fluorescentes de transferencia de energía. En general, entre los procesos de transferencia energética que implican pigmentos se incluyen las interacciones de resonancia dipolo-dipolo entre las fracciones donadora y aceptora que se encuentran asociados a moléculas biológicas iguales o diferentes. En estos procesos, en el caso de que las fracciones donadora y aceptora se sitúen suficientemente próximas entre sí y en las orientaciones mutuas correctas, la energía emitida por las fracciones donadoras resulta absorbida por las fracciones aceptoras. Se producen señales detectables cuando dicha energía absorbida provoca la fluorescencia de las fracciones aceptoras. Entre los enfoques ejemplares de análisis de ácidos nucleicos que utilizan comúnmente pigmentos fluorescentes de transferencia energética se incluyen los ensayos basados en la hibridación, tales como los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR)), los procedimientos basados en matrices de alta densidad de ácidos nucleicos, los análisis de polimorfismos de nucleótido único (SNP) y las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos.A título de ilustración adicional, también se conocen algunos métodos de ensayo de otros tipos de moléculas biológicas que pueden utilizar la transferencia energética para realizar la detección. Por ejemplo, pueden detectarse y cuantificarse proteínas utilizando diversas técnicas, incluyendo la electroforesis en gel de SDSpoliacrilamida, la electroforesis capilar, los ensayos enzimáticos, los ensayos basados en células y un amplio abanico de técnicas inmunológicas, tales como la transferencia western y el ELISA. Además, se han desarrollado varios ensayos diagnósticos y analíticos que implican la detección de múltiples componentes en una muestra utilizando pigmentos fluorescentes, incluyendo, por ejemplo, la citometría de flujo (Lanier et al. "Human lymphocyte subpopulations identified by using three-color immunofluorescence and flow cytometry analysis: correlation of Leu-2, Leu-3, Leu-7, Leu-8 and Leu-11 cell surface antigen expression", J. Immunol. 132:151-156, 1984) y el análisis de cromosomas (Gray et al. "High resolution chromosome analysis: one and two parameter flow cytometry", Chromosoma 73:9-27, 1979), conjuntamente con muchos de los ensayos indicados anteriormente. Para estos ensayos, resulta deseable utilizar simultáneamente un conjunto de dos o más pigmentos fluorescentes espectralmente resolubles, de manera que pueda detectarse más de una sustancia diana en la muestra simultáneamente. La detección simultánea de múltiples componentes en una muestra utilizando múltiples pigmentos reduce el tiempo requerido para detectar en serie componentes individuales en una muestra. En el caso de los ensayos multi-loci de sonda de ADN, la utilización de múltiples pigmentos fluorescentes espectralmente resolubles reduce el número de probetas necesario, simplificando de esta manera los protocolos experimentales y facilitando la fabricación de kits específicos para la aplicación. En el caso de la secuenciación automática de ADN, por ejemplo, la utilización de múltiples pigmentos fluorescentes espectralmente resolubles permite el análisis de las cuatro bases en un único carril, incrementando de esta manera el rendimiento en comparación con los métodos monocromáticos y eliminando incertidumbres asociadas a variaciones de movilidad electroforética entre carriles. La detección de PCR multiplex utilizando sondas de nucleasa 5', balizas moleculares, sondas FRET o de hibridación, entre otros métodos de detección multiplex, típicamente incluye el agrupamiento de sondas fluorescentes desactivadas o no desactivadas, por ejemplo para mejorar el rendimiento del ensayo en comparación con los protocolos que utilizan sondas únicas en una reacción dada. A título ilustrativo, los ensayos multiplex se utilizan comúnmente para detectar múltiples marcadores genotípicos o patógenos en muestras obtenidas de pacientes como partes de procedimientos diagnósticos. En estos formatos, la línea base global o fluorescencia de fondo de las sondas agrupadas se incrementa aditivamente a medida que se incrementa el número de sondas en la mezcla de reacción. Dicha fluorescencia de línea base también se incrementa en esencialmente cualquier sistema de ensayo al incrementar la cantidad de cualquier sonda individual. La fluorescencia de línea base afecta negativamente al rendimiento de un ensayo dado, por ejemplo al reducir la sensibilidad de detección y rango dinámico del ensayo. Por consiguiente, la fluorescencia de línea base limita efectivamente el número total de sondas fluorescentes y/o la cantidad de una sonda dada que puede utilizarse cada vez en un ensayo particular. 2   DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona moléculas biológicas y otros reactivos relacionados con la transferencia de energía no fluorescente. En particular, las moléculas biológicas que incluyen fracciones donadoras sustancialmente no fluorescentes indicadas en la presente memoria pueden utilizarse para llevar a cabo la detección de moléculas biológicas diana. Entre las ventajas de utilizar dichas fracciones donadoras para dicha detección se encuentra una menor fluorescencia de fondo en comparación con enfoques que utilizan fracciones donadoras fluorescentes. Además de mezclas de reacción y diversos métodos, también se proporcionan kits y sistemas relacionados. La invención en particular proporciona una molécula biológica que comprende por lo menos una fracción donadora sustancialmente no fluorescente que comprende uno o más de entre: 4',5-dimetoxi-6-carboxifluoresceína, 4',5'- dimetoxi-5-carboxifluoresceína, 6-carboxi-aminopentaclorofluoresceína ó 5-carboxi-aminopentaclorofluoresceína, siendo capaz dicha fracción donadora no fluorescente de transferir energía no fluorescente a por lo menos una fracción aceptora o informadora (por ejemplo un pigmento fluorescente) en el caso de que la fracción aceptora se encuentre suficientemente próxima a la fracción donadora sustancialmente no fluorescente, de manera que la fracción aceptora emite luz en respuesta a la energía no fluorescente aceptada. La molécula biológica típicamente comprende por lo menos un nucleósido, por lo menos un aminoácido, por lo menos un azúcar y/o por lo menos un lípido. En determinadas realizaciones, la molécula biológica comprende la fracción aceptora y/o por lo menos una fracción desactivadora. En algunas realizaciones, la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y/o la fracción aceptora se encuentran unidos a la molécula biológica mediante por lo menos una fracción conectora. Las moléculas biológicas indicadas en la presente memoria incluyen muchas realizaciones diferentes. A título ilustrativo, la molécula biológica comprende un reactivo de síntesis de polímero biológico (por ejemplo una fosforamidita) en determinadas realizaciones. En algunas realizaciones, la molécula biológica comprende un polímero biológico. En dichas realizaciones, diferentes unidades monoméricas del polímero biológico comprenden opcionalmente la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y la fracción aceptora. En algunas de dichas realizaciones, una unidad monomérica del polímero biológico comprende tanto la fracción donadora sustancialmente no fluorescente como la fracción aceptora. Opcionalmente, la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y la fracción aceptora no se encuentran unidos entre sí mediante por lo menos una fracción conectora. A título de ilustración adicional, la molécula biológica comprende por lo menos un oligonucleótido o por lo menos un polinucleótido en determinadas realizaciones. El oligonucleótido generalmente comprende un primer ácido nucleico o un ácido nucleico sonda (por ejemplo una sonda de hibridación, una sonda 5'-nucleasa y una sonda en horquilla). En algunas realizaciones, la molécula biológica comprende por lo menos un... [Seguir leyendo]

1. Molécula biológica que comprende por lo menos un oligonucleótido o por lo menos un polinucleótido y por lo menos una fracción donadora sustancialmente no fluorescente, que comprende uno o más de entre: 4',5'dimetoxi-6-carboxifluoresceína, 4',5'-dimetoxi-5-carboxifluoresceína, 6-carboxi-aminopentaclorofluoresceína ó 5- carboxi-aminopentaclorofluoresceína, siendo capaz dicha fracción donadora no fluorescente de transferir energía no fluorescente a por lo menos una fraccióna ceptora en el caso de que la fracción aceptora se encuentre suficientemente próxima a la fracción donadora sustancialmente no fluorescente, de manera que la fracción aceptora emita luz en respuesta a la energía no fluorescente aceptada, en el que los picos de absorbancia de luz visible de la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y la fracción aceptora difieren entre sí en aproximadamente 100 nm o más. 2. Molécula biológica según la reivindicación 1, en la que una proporción entre la emisión fluorescente absoluta detectable de un grupo de 6-carboxifluoresceína y una emisión fluorescente absoluta detectable de dicho grupo donador sustancialmente no fluorescente a concentraciones sustancialmente idénticas de la fracción 6carboxifluoresceína y de la fracción donadora sustancialmente no fluorescente es de aproximadamente 1.000:1 ó superior. 3. Molécula biológica según la reivindicación 1, en la que la molécula biológica comprende la fracción aceptora. 4. Molécula biológica según la reivindicación 3, en la que la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y la fracción aceptora no se encuentran unidos entre sí mediante por lo menos una fracción conectora. 5. Molécula biológica según la reivindicación 3, en la que la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y la fracción aceptora se encuentran unidos a la molécula biológica mediante por lo menos una fracción conectora. 6. Molécula biológica según la reivindicación 5, en la que la fracción conectora no presenta la estructura: en la que R 4 es un alquilo C1-5 unido a la fracción donadora sustancialmente no fluorescente, R 5 se selecciona de entre el grupo que consiste de: NH, S y O, R6 se selecciona de entre el grupo que consiste de: un alqueno, un dieno, un alquino y un anillo de cinco o seis elementos que presenta por lo menos un enlace insaturado o una estructura de anillos fusionados que se encuentra unida al carbono del carbonilo; y R7 comprende un grupo funcional que une la fracción conectora a la fracción aceptora. 7. Molécula biológica según la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido comprende un ácido nucleico cebador o un ácido nucleico sonda. 8. Molécula biológica según la reivindicación 7, en la que el ácido nucleico sonda comprende una sonda de hibridación, una sonda 5'-nucleasa o una sonda en horquilla. 9. Mezcla de reacción, que comprende por lo menos un nucleótido, por lo menos un ácido nucleico cebador y/o por lo menos un primer ácido nucleico sonda, en la que uno o más de entre el nucleótido, el ácido nucleico cebador o el primer ácido nucleico sonda comprende por lo menos una fracción donadora sustancialmente no fluorescente, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 10. Mezcla de reacción según la reivindicación 9, en la que el nucleótido, el ácido nucleico cebador o el primer ácido nucleico sonda comprende la fracción aceptora. 11. Método para detectar una molécula biológica diana que comprende un ácido nucleico diana, comprendiendo el método: (a) unir por lo menos una molécula biológica sonda a una molécula biológica diana, en la que la molécula biológica sonda comprende por lo menos una fracción donadora sustancialmente no fluorescente, que comprende uno o más de entre: 4',5'-dimetoxi-6-carboxifluoresceína, 4',5'-dimetoxi-5-carboxifluoresceína, 6-carboxiaminopentaclorofluoresceína ó 5-carboxi-aminopentaclorofluoresceína, y por lo menos una fracción aceptora, aceptando la fracción aceptora energía no fluorescente transferida de la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y emitiendo luz en respuesta a la energía no fluorescente aceptada, y 44   (b) detectar la luz emitida por la fracción aceptora, detectando de esta manera las moléculas biológicas diana que comprenden un ácido nucleico diana. 12. Método según la reivindicación 11, en el que la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y la fracción aceptora se encuentran unidos entre sí mediante por lo menos una fracción conectora. 13. Método según la reivindicación 12, en el que la fracción conectora no presenta la estructura: en la que R4 es un alquilo C1-5 unido a la fracción donadora sustancialmente no fluorescente, R5 se selecciona de entre el grupo que consiste de NH, S y O, R6 se selecciona de entre el grupo que consiste de: un alqueno, un dieno, un alquino y un anillo de cinco o seis elementos que presenta por lo menos un enlace insaturado o una estructura de anillos fusionados que se encuentra unida al carbono del carbonilo; y R7 comprende un grupo funcional que une la fracción conectora a la fracción aceptora. 14. Método según la reivindicación 11, en el que la molécula biológica de sonda comprende un ácido nucleico y una sonda de hibridación, una sonda 5'-nucleasa o una sonda en horquilla. 15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende: (a1) proporcionar por lo menos una primera y una segunda moléculas biológicas, en las que la primera molécula biológica de sonda comprende por lo menos una fracción donadora sustancialmente no fluorescente, que comprende uno o más de entre: 4',5'-dimetoxi-6-carboxifluoresceína, 4',5'-dimetoxi-5-carboxifluoresceína, 6-carboxiaminopentaclorofluoresceína ó 5-carboxi-aminopentaclorofluoresceína, y en el que la segunda molécula biológica de sonda comprende por lo menos una fracción aceptora, y (a2) unir la primera y segunda moléculas biológicas de sonda a la molécula biológica diana, de manera que la fracción aceptora acepta energía no fluorescente transferida por la fracción donadora sustancialmente no fluorescente y emite luz en respuesta a la energía no fluorescente aceptada. 16. Método según la reivindicación 11 ó 15, en el que la molécula biológica diana comprende un ácido nucleico diana y el método comprende amplificar por lo menos una subsecuencia del ácido nucleico diana antes y/o durante la detección de la luz emitida por la fracción aceptora, detectando de esta manera la molécula biológica diana que comprende un ácido nucleico diana. 17. Método según la reivindicación 15, en el que la primera y/o la segunda moléculas biológicas de sonda comprenden un ácido nucleico y una sonda de hibridación, una sonda 5'-nucleasa o una sonda en horquilla. 18. Método de extensión de un ácido nucleico cebador, comprendiendo el método incubar un ácido nucleico diana con: (a) por lo menos un nucleótido extensible y/o por lo menos un nucleótido terminador, (b) por lo menos un catalizador biológico que incorpora nucleótidos, y (c) por lo menos un ácido nucleico cebador que es por lo menos parcialmente complementario a por lo menos una subsecuencia del ácido nucleico diana, bajo condiciones en las que el catalizador biológico que incorpora nucleótidos extiende el ácido nucleico cebador, produciendo por lo menos un ácido nucleico cebador extendido mediante la incorporación del nucleótido extensible y/o el nucleótido terminador en un extremo terminal del ácido nucleico cebador extendido, en el que el ácido nucleico cebador, el nucleótido extensible y/o el nucleótido terminador comprenden por lo menos una fracción donadora sustancialmente no fluorescente, comprendiendo uno o más de entre: 4',5'-dimetoxi-6-carboxifluoresceína, 4',5'-dimetoxi-5-carboxifluoresceína, 6-carboxiaminopentaclorofluoresceína ó 5-carboxi-aminopentaclorofluoresceína, siendo capaz dicho grupo donador no fluorescente de transferir energía no fluorescente a por lo menos una fracción aceptora en el caso de que la fracción aceptora se encuentre suficientemente próxima a la fracción donadora sustancialmente no fluorescente para que la fracción aceptora emita luz en respuesta a la energía no fluorescente absorbida, extendiendo de esta manera el ácido nucleico cebador. 19. Método según la reivindicación 18, en el que el ácido nucleico cebador, el nucleótido extensible y/o el nucleótido terminador comprenden la fracción aceptora. 20. Kit, que comprende por lo menos una primera molécula biológica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.   21. Sistema, que comprende: (a) por lo menos un recipiente y/o soporte sólido que comprende por lo menos una molécula biológica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, (b) por lo menos una fuente de radiación que se encuentra configurada para dirigir radiación electromagnética a la fracción donadora, y (c) por lo menos un componente de detección que se encuentra configurado para detectar la luz emitida por la fracción aceptora en el caso de que ésta se encuentre suficientemente próxima a dicha fracción donadora sustancialmente no fluorescente. 46   47   48   49     51   52   53   54     56   57   58   59     61   62   63   64     66   67   68   69     71   72   73   74     76   77   78   79     81   82   83   84     86   87   88   89     91   92   93   94     96   97   98   99     101   102   103   104