Anticuerpos monoclonales y sus derivados sintéticos y biotecnológicos que actúan como moléculas antagonistas de NGF.

Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos,

capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA.

Anticuerpos monoclonales y sus derivados sintéticos y biotecnológicos que actúan como moléculas antagonistas del NGF.

El presente invento se refiere a anticuerpos monoclonales, y a sus derivados sintéticos y biotecnológicos, que actúan como moléculas antagonistas del NGF.

Más en particular, el invento se refiere a un anticuerpo monoclonal, y a sus derivados sintéticos y recombinantes, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (del inglés, Nerve Growth Factor) (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA. El invento también concierne a los usos diagnósticos y terapéuticos de esas moléculas y de composiciones relacionadas.

Las neurotrofinas son una familia de factores de crecimiento peptídicos (Barde, 1994), estructuralmente relacionados con el primer miembro de la familia, el NGF (factor de crecimiento nervioso, Levi-Montalicini, 1987). Las neurotrofinas modulan la diferenciación y supervivencia neuronales, así como la transmisión sináptica, tanto de las neuronas periféricas como de las del sistema nervioso central. Además, el NGF actúa sobre varios tejidos y células no neuronales, como las células del sistema inmunitario.

El NGF actúa a través de dos receptores de membrana presentes en las células diana, el receptor p75 de baja afinidad, y la glicoproteína transmembranal TrkA, de alta afinidad y de 140 kDa (Kaplan y col., 1991, Klein y col., 1991) que tiene actividad de tirosina-quinasa. La TrkA se expresa en las neuronas de las crestas neurales, en las neuronas del sistema simpático así como en neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal y del cuerpo estriado, en las que representa el mediador crucial de las actividades del NGF (Holtzman y col., 1992, Verge y col., 1992). La TrkA también se expresa en algunos tejidos y células no neuronales, que incluyen los linfocitos B (Torcia y col., 1996).

La técnica anterior sugiere el uso potencial del NGF en el tratamiento de diferentes patologías neurodegenerativas, que incluyen la enfermedad de Alzehimer (Lindsay y col., 1994; Ebendal y col., 1991), y otras patologías, como diabetes mellitus y lepra (Anand y col., 1996). Sin embargo, los ensayos clínicos iniciales fueron desalentadores, complicados por las dificultades de suministro, por la farmacocinética en el sistema nervioso central, y por las propiedades agonistas negativas del NGF contra otras dianas periféricas, fuera del sistema nervioso central, que conducen a estímulos excesivos y no deseados.

Por lo tanto, hace falta desarrollar moléculas antagonistas selectivas de la interacción NGF-receptor TrkA y derivados farmacológicamente activos de las mismas, que sean suministradas con facilidad.

Además, la sobreproducción de NGF en diferentes trastornos inflamatorios se había relacionado con el aumento de la sensibilidad al dolor de los nociceptores primarios aferentes, contribuyendo así a la presencia de un estado de dolor crónico. La población de neuronas sensitivas que son sensibles a daños tisulares (nociceptores) es particularmente dependiente de NGF. Además, considerando los inconvenientes y limitaciones de las dos clases de fármacos analgésicos existentes (fármacos anti-inflamatorios no esteroideos y opioides), la provisión de una nueva diana diferente, como es el NGF, representa un progreso en la técnica (Snider y McMahon, 1998). Y además, según lo sugerido por Levine (Levine, 1988), el NGF proporciona una diana potencial para el diseño de nuevos tratamientos para el dolor, especialmente para aquellos dolores resultantes de trastornos inflamatorios o neuropáticos, para los que los fármacos convencionales son menos efectivos. Por último, estudios recientes han mostrado una relación directa entre el dolor y el sistema TrkA, demostrando, en cuatro casos no relacionados de insensibilidad crónica al dolor de tipo 4, con anhidrosis, la presencia de mutaciones del gen TrkA y, en consecuencia, la ausencia de receptores funcionales para NGF (Indo y col., 1996; Wood, 1996).

Por consiguiente, el sistema NGF-TrkA proporciona una diana potencial para diseñar tratamientos para el dolor, es decir, tratamientos capaces de antagonizar el síndrome del dolor neuropático por medio de antagonistas efectivos frente a TrkA (Levine, 1998; Sneider y Mcmahon, 1998).

La expresión aberrante del mRNA de receptores TrkA se había relacionado también con patologías neoplásicas. El pronóstico de tumores que expresan TrkA, su diagnóstico mediante formación de imágenes así como su tratamiento, representan un área de aplicación de anticuerpos que tienen una elevada afinidad por TrkA. De hecho, en estos tumores, los agentes que se unen a TrkA representan herramientas útiles para el diagnóstico clínico, el pronóstico y los tratamientos terapéuticos (Kramer y col., 1997).

Los anticuerpos recombinantes (Vaughan y col., 1998) representan reactivos de partida de elección para el desarrollo de moléculas pequeñas que mimeticen su actividad (Le Sauteur y col., 1995).

Debeir y col., PNAS, Marzo, 1.999, Vol. 96, págs. 4067-4072, describen un péptido pequeño que inhibe la interacción entre NGF y TrkA.

Un anticuerpo monoclonal agonista de TrkA fue descrito por Le Sauteur y col., 1996, en la solicitud de PCT n.º WO97/21732. La actividad agonista del único anticuerpo descrito (5C3) le hace no adecuado para los objetivos del presente invento y para todas las situaciones en las que debe evitarse la hiperactivación del receptor TrkA. La solicitud de PCT n.º WO97/21732 describe el uso en pruebas diagnósticas de formación de imágenes del anticuerpo agonista 5C3. Sin embargo este anticuerpo, debido a su actividad agonista, no puede ser utilizado para la aplicación anteriormente mencionada, a menos que la activación del receptor no esté impedida.

Por lo tanto, resulta evidente que es necesario desarrollar nuevas moléculas adecuadas para interferir con la unión del NGF a TrkA, para proporcionar nuevas actividades terapéuticas y, en particular, para proporcionar un anticuerpo TrkA que actúe como antagonista y sea por ello ideal para bloquear la activación del receptor producida por un ligando endógeno (NGF), y que no presente actividad de activación del receptor. Además ese anticuerpo podría utilizarse ventajosamente en el desarrollo de reactivos, es decir, de fragmentos sintéticos y recombinantes que bloqueen la interacción NGF-TrkA.

El autor del presente invento ha aislado varios anticuerpos monoclonales capaces de interaccionar con la unión NGF-receptor, denominados TrkA. Entre estos anticuerpos monoclonales, un anticuerpo, el denominado MNAC13, actúa como un potente antagonista de TrkA, inhibiendo la unión del NGF a TrkA. Este anticuerpo representa una herramienta muy efectiva en la prevención de la activación funcional de TrkA por NGF en diversos sistemas biológicos.

El anticuerpo se obtuvo mediante inmunización congénica de ratones Balb/C, con un receptor TrkA natural humano, expresado en células Balb/C 3T3. El escrutinio se basó en la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión del NGF a las células que expresan TrkA. Esto condujo al aislamiento de anticuerpos capaces de unirse a TrkA en su dominio de unión a NGF, impidiendo así la unión de NGF. El anticuerpo MNAC13 es muy efectivo para prevenir la activación funcional de TrkA producida por NGF en diferentes sistemas biológicos. El autor del presente invento ha clonado también los genes que codifican las regiones variables del anticuerpo MNAC13 y, mediante técnicas de DNA recombinante, ha ensamblado esas regiones en un polipéptido funcional de tamaño reducido (fragmento Fv de cadena sencilla, scFvMNAC13), confirmando que este polipéptido conserva las propiedades del anticuerpo de origen.

Anticuerpo agonista significa un anticuerpo capaz de activar el antígeno del receptor en ausencia del ligando natural del propio receptor.

Anticuerpo antagonista significa un anticuerpo dirigido contra el sitio activo del receptor antigénico, y que es capaz de inhibir la actividad del ligando natural que está en competición con el anticuerpo mencionado por la unión al mismo receptor.

Derivados sintéticos y biotecnológicos de un anticuerpo significan cualquier fragmento construido por ingeniería genética, sintetizado por técnicas químicas o recombinantes, que conserva las propiedades funcionales del anticuerpo.

1. Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA.

2. Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos según la reivindicación 1, en el que la región variable de la cadena ligera tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 23 hasta el aa 134 de SEQ ID No. 2.

3. Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos según la reivindicación 1, en el que la región variable de la cadena pesada tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 152 hasta el aa 276 de SEQ ID No. 2.

4. Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la región variable de la cadena ligera tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 23 hasta el aa 134 de SEQ ID No. 2 y la región variable de la cadena pesada tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 152 hasta el aa 276 de SEQ ID No. 2.

5. Un fragmento ScFv del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende al menos una de las regiones variables de la cadena ligera o de la cadena pesada del anticuerpo descrito en la reivindicación 1.

6. Un fragmento ScFv según la reivindicación 5, que comprende una región variable de la cadena ligera y de la cadena pesada del anticuerpo descrito en la reivindicación 1.

7. El fragmento ScFv según la reivindicación 6, que comprende una secuencia enlazadora situada entre la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada.

8. El fragmento ScFv según la reivindicación 7, en el que dicho fragmento ScFv tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID No. 2.

9. Un derivado sintético o biotecnológico según la reivindicación 1, que comprende al menos una de las regiones determinantes de la complementaridad (CDR) del anticuerpo, y que es capaz de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA.

10. Un derivado sintético o biotecnológico según la reivindicación 9, en el que dicha región determinante de la complementaridad (CDR) del anticuerpo y que es capaz de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, está dentro de la región variable de la cadena pesada que va desde el aa 152 hasta el aa 276 de SEQ ID No. 2.

11. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

12. Un ácido nucleico según la reivindicación 11, que codifica el fragmento ScFv de SEQ ID No. 2.

13. Un ácido nucleico según la reivindicación 12, que tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID No. 1.

14. El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, para la producción de animales transgénicos no humanos, preferiblemente ratones, en el que el anticuerpo o su derivado según las reivindicaciones 1-10, se expresa de un modo inducible o bajo el control de promotores que determinan la expresión en el animal adulto.

15. Un animal transgénico no humano que se transforma con un ácido nucleico según las reivindicaciones 11-13, expresándose dicho ácido nucleico de un modo inducible o bajo el control de promotores que determinan la expresión en el animal adulto.

16. Un fago o un vector procariótico recombinante que comprende y es capaz de expresar de manera correcta y efectiva el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13.

17. Un vector eucariótico recombinante que comprende y es capaz de expresar de manera correcta y efectiva el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13.

18. Una composición farmacológica que comprende una cantidad efectiva del vector según la reivindicación 17 y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para la terapia génica de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.

19. Una composición farmacológica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o de sus derivados sintéticos o biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición farmacológica según la reivindicación 19, para el tratamiento de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.

21. Una composición farmacéutica que comprende cantidades farmacéuticamente activas de NGF y del anticuerpo o de sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

22. Células eucarióticas manipuladas por ingeniería genética, capaces de expresar el anticuerpo o sus derivados según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

23. Una composición farmacológica que comprende células según la reivindicación 22, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para la terapia génica de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.

24. Una composición que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o de sus derivados sintéticos o biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y un excipiente diagnósticamente aceptable para usar en pruebas diagnósticas in vivo de formación de imágenes.