Anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo,

que:

(a) se une específicamente a αvß6 y no a otras integrinas αv,

(b) inhibe la unión de αvß6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvß6 D5 en un tampón que comprende los cationes divalentes Ca2+ y Mg2+; y

(c) compite con el anticuerpo producido por el hibridoma 6.8G6 que presenta el número de acceso de la ATCC PTA-3645 para la unión a αvß6 biotinilado en un tampón que comprende los cationes divalentes Ca2+ y Mg2 .

Anticuerpos anti-αvβ6.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general al campo de la biología molecular y concretamente a anticuerpos contra las integrinas αvβ6.

Antecedentes de la invención

Las integrinas son una superfamilia de receptores de superficie celular que media en la adhesión célula-célula y célula-matriz. Estas proteínas es conocido que proporcionan anclaje, así como señales, para el crecimiento, migración y diferenciación celulares durante el desarrollo y la reparación de tejidos. Las integrinas también se han implicado en la desdiferenciación e invasión celulares, especialmente en el caso de que las células pierdan su forma especializada y se conviertan en células cancerosas metastatizantes.

Las integrinas son proteínas heterodiméricas compuestas de dos subunidades unidas no covalentemente: α y β. La especificidad de unión de las integrinas está dictada por la combinación de 8 cadenas α diferentes con 8 cadenas β diferentes. La integrina αvβ6 puede unirse a varios ligandos, entre ellos la fibronectina, la tenascina, la vitronectina y el recientemente identificado péptido asociado a latencia, "LAP", un péptido de 278 aminoácidos sintetizado como parte de la proteína precursora TGF-β (Munger et al., Cell 96 (3) :319-328, 1999) . El LAP es cortado a partir de la forma madura de la proteína TGF-β en forma de péptido N-terminal durante la secreción, pero sigue asociado no covalentemente a TGF-β para mantener su estado latente. Este complejo no puede unirse al receptor de TGF-β y por lo tanto no es biológicamente activo. La integrina αvβ6 puede unirse directamente a un motivo RGD contenido dentro de LAP, resultando en la liberación del mismo y en la activación de TGF-β. Debido a que la unión de αvβ6a LAP podría resultar importante en la conversión de TGF-β a su estado activo, el bloqueo de la unión podría resultar en la inhibición de la activación de TGF-β mediada por αvβ6 y en la patología fibrótica asociada.

El D1 (Huang et al., patente US nº 2001/0056076A1) da a conocer métodos y composiciones que comprenden antagonistas de αvβ6. Se dan a conocer para el tratamiento de la fibrosis por lesión aguda pulmonar. Se dan a conocer además métodos de tratamiento de la fibrosis por lesión aguda pulmonar.

El D2 (Xue et al., BBRC vol. 288, páginas 610-618, 2001) da a conocer el papel de la integrina αvβ6 en el crecimiento in vivo e in vitro del carcinoma oral de células escamosas humano. La expresión de αvβ6 se describe en muestras diferentes; su función en la adhesión y en otros fenómenos ha sido descrita y se informa de estudios en ratones.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento y la caracterización de anticuerpos de alta afinidad contra αvβ6, incluyendo la identificación y análisis de residuos aminoácidos clave en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de dichos anticuerpos.

La presente invención comprende un anticuerpo monoclonal que: (a) se une específicamente a αvβ6, (b) inhibe la unión de αvβ6 a su ligando, tal como LAP, fibronectina, vitronectina y tenascina con un valor de IC50 inferior al de 10D5 (solicitud publicada de patente internacional WO 99/07405) , (c) bloquea la activación de TGF-β, (d) contiene determinadas secuencias de aminoácidos en las CDR (por ejemplo aquellas mostradas en las figuras 7A y 7B) que proporcionan especificidad de unión a αvβ6, (e) se une específicamente a la subunidad β6, y/o (f) reconoce αvβ6 en los procedimientos de inmunotinción, tales como la inmunotinción de tejidos incluidos en parafina.

Se ha descubierto que los anticuerpos que se unen a αvβ6 pueden agruparse en clases y subclases biofísicamente diferenciadas. Una clase de anticuerpos muestra la capacidad de bloquear la unión de un ligando (por ejemplo LAP) a αvβ6 (bloqueantes) . Esta clase de anticuerpos puede dividirse adicionalmente en subclases de bloqueantes dependientes de cationes y bloqueantes independientes de cationes. Algunos de los bloqueantes dependientes de cationes contienen una secuencia peptídica de arginina-glicina-aspartato (RGD) , mientras que los bloqueantes independientes de cationes no contienen una secuencia RGD. Otra clase de anticuerpos muestra la capacidad de unirse a αvβ6 y sin embargo no bloquea la unión de αvβ6 a un ligando (no bloqueantes) .

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en algunas formas de realización de la presente invención, algunos anticuerpos de la presente invención son dependientes de cationes divalentes para la unión a αvβ6, mientras que otros son independientes de cationes. Son cationes ejemplares Ca2+, Mg2+ y Mn2+.

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que:

(a) se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas av,

(b) inhibe la unión de αvβ6 a péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo antiαvβ6 10D5 en un tampón que comprende los cationes divalentes Ca2+ y Mg2+, y

(c) compite con el anticuerpo producido por el hibridoma 6.8G6, que presenta el número de acceso de la ATCC PTA-3645 para la unión a αvβ6 biotinilado en un tampón que comprende los cationes divalentes Ca2+ y Mg2+.

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se ha mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende:

a) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma 6.1A8, número de acceso de la ATCC PTA-3647, o

b) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma 6.3G9, número de acceso de la ATCC PTA-3649, o

c) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma 6.8G6, número de acceso de la ATCC PTA-3645, o

d) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma 6.2B1, número de acceso de la ATCC PTA-3646, o

e) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma 7.1G10, número de acceso de la ATCC PTA-3898, o

f) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma 7.7G5, número de acceso de la ATCC PTA-3899, o

g) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma 7.1C5, número de acceso de la ATCC PTA-3900,

Convenientemente, la unión entre el anticuerpo y αvβ6 es independiente de los cationes divalentes.

La invención se refiere a un anticuerpo anti-αvβ6 tal como se ha mencionado anteriormente, comprendiendo dicho anticuerpo una secuencia de dominio variable de cadena pesada de cualquiera de entre SEC ID nº 19 a nº 24, SEC ID nº 34, SEC ID nº 35 o SEC ID nº 36, en la que dicho anticuerpo se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas αv o integrinas no específicas, e inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvβ6 10D5.

La invención se refiere a un anticuerpo anti-αvβ6 tal como se ha indicado anteriormente, comprendiendo dicho anticuerpo una secuencia de aminoácidos de cualquiera de entre SEC ID nº 19 a nº 24, nº 34 a nº 38, nº 40, nº 41, nº 43 a nº 45, en la que dicho anticuerpo se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas αv o integrinas no específicas, e inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvβ6 10D5.

La invención se refiere a un anticuerpo anti-αvβ6 tal como se ha indicado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad 1, 2 y 3 de cadena pesada y las regiones determinantes de complementariedad... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, que:

(a) se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas αv,

(b) inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvβ6 10D5 en un tampón que comprende los cationes divalentes Ca2+ y Mg2+; y

(c) compite con el anticuerpo producido por el hibridoma 6.8G6 que presenta el número de acceso de la ATCC PTA-3645 para la unión a αvβ6 biotinilado en un tampón que comprende los cationes divalentes Ca2+ y Mg2+.

2. Anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende:

a) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesadas y ligeras que un anticuerpo producido por el hibridoma 6.1A8 de número de acceso de la ATCC PTA-3647; o

b) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesadas y ligeras que un anticuerpo producido por el hibridoma 6.3G9 de número de acceso de la ATCC PTA-3649; o

c) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesadas y ligeras que un anticuerpo producido por el hibridoma 6.8G6 de número de acceso de la ATCC PTA-3645; o

d) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesadas y ligeras que un anticuerpo producido por el hibridoma 6.2B1 de número de acceso de la ATCC PTA-3646; o

e) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesadas y ligeras que un anticuerpo producido por el hibridoma 7.1G10 de número de acceso de la ATCC PTA-3898; o

f) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesadas y ligeras que un anticuerpo producido por el hibridoma 7.7G5 de número de acceso de la ATCC PTA-3899; o

g) las mismas secuencias polipeptídicas de cadenas pesadas y ligeras que un anticuerpo producido por el hibridoma 7.1C5 de número de acceso de la ATCC PTA-3900.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que la unión entre el anticuerpo y αvβ6 es independiente de cationes divalentes.

4. Anticuerpo anti-αvβ6 según la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo una secuencia de dominio variable de cadena pesada de cualquiera de entre SEC ID nº 19 a nº 24, SEC ID nº 34, SEC ID nº 35 o SEC ID nº 36, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas αv o a integrinas no específicas, e inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvβ6 10D5.

5. Anticuerpo anti-αvβ6 según la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo una secuencia de aminoácidos de cualquiera de entre SEC ID nº 19 a nº 24, nº 34 a nº 38, nº 40, nº 41, nº 43 a nº 45, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas αv o integrinas no específicas, e inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvβ6 10D5.

6. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad 1, 2 y 3 de cadena pesada y las regiones determinantes de complementariedad 1, 2 y 3 de cadena ligera, en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 de cadena pesada comprenden las secuencias SEC ID nº 3, nº 6 y nº 9, respectivamente, y en el que las CDR de cadena ligera comprenden las secuencias SEC ID nº 12, nº 14 y nº 18, respectivamente, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas αv o integrinas no específicas, e inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvβ6 10D5.

7. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se une a αvβ6 soluble pero no se une a la subunidad β6.

8. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo evita la activación de TGF-β.

9. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad 1, 2 y 3 de cadena pesada y las regiones determinantes de complementariedad 1, 2 y 3 de cadena ligera, en el que dicho anticuerpo compite con 6.8G6 de número de acceso de la ATCC PTA-3645 para la unión a αvβ6 y contiene un motivo FXY en CDR3 de la cadena pesada, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas αv o integrinas no específicas, e inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvβ6 10D5.

10. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo contiene una mutación en un residuo aminoácido que es un sitio de glucosilación, de manera que se elimina el sitio de glucosilación.

11. Anticuerpo según la reivindicación 1, producido mediante el hibridoma seleccionado de entre el grupo constituido por 6.1A8 de número de acceso de la ATCC PTA-3647; 6.3G9 de número de acceso de la ATCC PTA-3649; 6.8G6 de número de acceso de la ATCC PTA-3645; 6.2B1 de número de acceso de la ATCC PTA-3646; 7.1G10 de número de acceso de la ATCC PTA-3898; 7.7G5 de número de acceso de la ATCC PTA-3899; 7.1C5 de número de acceso de la ATCC PTA-3900; o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo producido por dicho hibridoma.

12. Anticuerpo anti-αvβ6 según la reivindicación 1, que se une específicamente a αvβ6 y no a otras integrinas αvo integrinas no específicas e inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo anti-αvβ6 10D5 seleccionado de entre el grupo constituido por un anticuerpo:

a) cuyas regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 de cadena pesada comprenden las secuencias SEC ID nº 1, nº 4 y nº 7, respectivamente, y cuyas CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera comprenden las secuencias SEC ID nº 10, nº 13 y nº 15, respectivamente;

b) cuyas regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 de cadena pesada comprenden las secuencias SEC ID nº 3, nº 5 y nº 8, respectivamente, y cuyas CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera comprenden las secuencias SEC ID nº 11, nº 14 y nº 17, respectivamente;

c) cuyas regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 de cadena pesada comprenden las secuencias SEC ID nº 3, nº 6 y nº 9, respectivamente, y cuyas CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera comprenden las secuencias SEC ID nº 12, nº 14 y nº 18, respectivamente;

d) cuyas regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 de cadena pesada comprenden las secuencias SEC ID nº 2, nº 46 y nº 47, respectivamente, y cuyas CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera comprenden las secuencias SEC ID nº 48, nº 13 y nº 16, respectivamente.

13. Anticuerpo según la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo contiene una mutación en un residuo aminoácido que es un sitio de glucosilación, de manera que el sitio de glucosilación resulta eliminado.

14. Anticuerpo anti-αvβ6 o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, seleccionado de entre el grupo constituido por un anticuerpo que comprende:

a) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEC ID nº 19 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 37;

b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEC ID nº 20 o nº 21 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 38;

c) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEC ID nº 22 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 43;

d) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEC ID nº 23 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 44;

e) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEC ID nº 24 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 45;

f) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEC ID nº 34 o nº 35 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 40;

g) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEC ID nº 36 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 41.

15. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 que (a) se une específicamente a αvβ6, y (b) inhibe la unión de αvβ6 al péptido asociado a latencia (LAP) con un valor de IC50 inferior al del anticuerpo 10D5, en el que el anticuerpo es producido por el hibridoma 6.3G9, depositado con el número de acceso de la ATCC PTA-3649 o el hibridoma 6.8G6, depositado con el número de acceso de la ATCC PTA 3645.

16. Anticuerpo según la reivindicación 15, en el que la unión entre el anticuerpo y αvβ6 es dependiente de cationes divalentes.

17. Anticuerpo según la reivindicación 16, en el que el catión divalentes es Ca2+, Mg2+ o Mn2+.

18. Anticuerpo según la reivindicación 15, en el que la unión entre el anticuerpo y αvβ6 es independiente de cationes divalentes.

19. Anticuerpo anti-αvβ6 según la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo una secuencia de dominio

variable de cadena pesada de SEC ID nº 20 o nº 21 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 38.

20. Anticuerpo anti-αvβ6 según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEC ID nº 24 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEC ID nº 45.

21. Composición para prevenir o tratar una enfermedad mediada por αvβ6 en un mamífero, en la que la enfermedad es fibrosis, psoriasis, esclerosis, cáncer, lesión aguda pulmonar, lesión renal, lesión hepática o síndrome de Alport, que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la reivindicación 6 y las reivindicaciones 8 a 20, y un portador farmacéuticamente aceptable.

22. Composición según la reivindicación 21, en la que el anticuerpo se encuentra conjugado con un agente citotóxico.

23. Composición según la reivindicación 21, en la que el anticuerpo es dependiente de cationes divalentes.

24. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un sujeto que presenta, o en riesgo de presentar, una enfermedad mediada por αvβ6, en la que la enfermedad es fibrosis, psoriasis, esclerosis, cáncer, lesión aguda pulmonar, lesión renal, lesión hepática o síndrome de Alport.

25. Utilización según la reivindicación 24, en la que el sujeto es un ser humano.

26. Utilización según la reivindicación 24 o 25, en la que la fibrosis es esclerodermia, cicatrización, fibrosis hepática, fibrosis renal o fibrosis pulmonar.

27. Utilización según la reivindicación 24 o 25, en la que el cáncer es cáncer epitelial, oral, de piel, cervical, ovárico, faríngeo, esofágico, de cabeza y cuello, prostático, de colon, pancreático, laríngeo, pulmonar, mamario, renal o colorrectal.

28. Método in vitro de detección de αvβ6 en una muestra de tejido de un mamífero, que comprende poner en contacto la muestra de tejido con el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

29. Células seleccionada de entre el grupo constituido por una célula del hibridoma 6.1A8, de número de acceso de la ATCC PTA-3647; una célula del hibridoma 6.3G9, de número de acceso de la ATCC PTA-3649; una célula del hibridoma 6.8G6, de número de acceso de la ATCC PTA-3645; una célula del hibridoma 6.2B1, de número de acceso de la ATCC PTA-3646; una célula del hibridoma 7.1G10, de número de acceso de la ATCC PTA-3898; una célula del hibridoma 7.7G5, de número de acceso de la ATCC PTA-3899; y una célula del hibridoma 7.1C5, de número de acceso de la ATCC PTA-3900.