UTILIZACIÓN DE UNA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA EL DOMINIO DESINTEGRINA DE UNA ADAMALISINA COMO AGENTE ANTI-ANGIOGÉNICO, ANTI-INVASIVO Y ANTI-METASTÁSICO.

Molécula de ácido nucleico que comprende o que está constituida por una secuencia polinucleotídica que codifica el dominio desintegrina de la metargidina o un derivado de éste para una utilización como agente anti-angiogénico,

anti-invasivo o anti-metastásico, en la que dicho derivado del dominio desintegrina de la metargidina: - presenta unas propiedades anti-angiogénicas, anti-invasivas y antimetastásicas; y - está constituido por una secuencia modificada por deleción, adición o sustitución de un aminoácido del dominio desintegrina de la metargidina

La presente invención se refiere al campo de la inhibición de los eventos que concurren en el proceso angiogénico, invasivo y metastásico, el cual está implicado en numerosas patologías, tales como el cáncer, las enfermedades inflamatorias, la ateroesclerosis, y la angiogénesis patológica de la retina.

La invención se basa en la demostración de las funciones anti-angiogénicas, anti-invasivas y anti-metastásicas de un fragmento de una molécula presente en las células endoteliales humanas. La invención se refiere a la utilización de una molécula de ácido nucleico que comprende o que está constituida por una secuencia polinucleotídica que codifica el dominio desintegrina de la metargidina (Krätzschmar et al., 1996) designado asimismo a continuación "AMEP" por "anti-angiogenic metargidin peptide".

Este fragmento presenta la originalidad, con respecto a las demás sustancias anti-angiogénicas que han sido descritas en la bibliografía:

- de inhibir simultáneamente todas las etapas de la angiogénesis: la migración y la proliferación de las células endoteliales, su adhesión a diferentes sustratos de la matriz, la formación de estructuras de tipo capilar, y

- de inducir una apoptosis de las células endoteliales.

Además, de manera inesperada, este fragmento presenta la capacidad por un lado de inhibir la invasión de células cancerígenas y por otro lado de impedir la formación de metástasis, en particular de células que expresan en su superficie la integrina alfa v beta 3.

La angiogénesis designa un procedimiento morfogenético por el cual se forman nuevos capilares sanguíneos mediante el brote de vasos existentes en respuesta a una estimulación. Durante la angiogénesis in vivo, los neocapilares nacen a partir de los capilares o de las venillas post-capilares, jamás de las arterias, arteriolas o de las venas. Así, un factor angiogénico es una molécula que permite la iniciación y/o el mantenimiento de la angiogénesis, tal como, por ejemplo, el FGF2. Un factor anti-angiogénico es por lo tanto una molécula que inhibe la angiogénesis previendo una o varias etapas clave de la angiogénesis.

La adhesión consiste en la capacidad de las células para fijarse a una matriz extracelular. Este fenómeno utiliza numerosas moléculas de adhesión presentes en la superficie de las células.

La migración de las células utiliza unas enzimas que permiten que las células degraden los compuestos de la matriz, así como unas moléculas de adhesión que aseguran el anclaje de las células a la matriz. Además, la arquitectura dinámica del citoesqueleto permite que las células alternen los periodos de adhesión y de desprendimiento indispensables para la motilidad.

La proliferación es un fenómeno que se refiere a la división de las células a lo largo del tiempo.

La apoptosis consiste en la capacidad intrínseca de las células normales para iniciar su propio suicidio según un programa complejo denominado muerte celular. La anoikis es una forma de la apoptosis inducida en las células normales que resultan de una pérdida de su adhesión al sustrato.

La invasión es una multiplicación exagerada de una clase de elementos anatómicos que provoca la sustitución por éstos de los elementos adyacentes.

La metástasis es un foco de células cancerígenas, en relación con un cáncer pre-existente, denominado "primitivo", pero desarrollado a distancia de este último y sin continuidad con el mismo. La diseminación de estos focos secundarios se realiza por vía linfática o sanguínea.

El desarrollo de un tumor y su diseminación en diversos órganos dependen de la vascularización intra y perivascular denominada asimismo angiogénesis (Folkman, 1984). La diana del proceso angiogénico es un enfoque terapéutico nuevo y representa una revolución en el tratamiento de los cánceres. Así, numerosas moléculas anti-angiogénicas están actualmente en curso de ensayos clínicos.

La vitaxina es un anticuerpo anti-integrina alfa v beta 3 humanizado que induce una inhibición de la proliferación de las células endoteliales así como un efecto proapoptótico (Brooks et al., 1994; Hammes et al., 1996), pero no modifica su migración. La integrina alfa v beta 3 es una molécula de adhesión expresada preferentemente por las células endoteliales de los neovasos y ciertas células cancerígenas. Interactúa con ciertos compuestos de la matriz extracelular, en particular la vitronectina, la fibronectina, la laminina, el colágeno IV y la fibrina, induciendo la adhesión y la migración de las células endoteliales. Se ha descrito ampliamente el papel principal de la integrina alfa v beta 3 en la angiogénesis (para revisión, Eliceiri y Cheresh, 2000).

El marimastato bloquea la actividad proteolítica de las metaloproteinasas y por consiguiente inhibe la migración de las células endoteliales, pero no tiene ningún efecto sobre la proliferación de estas últimas. Las metaloproteinasas (MMP) pertenecen en efecto a la gran familia de las enzimas que permiten degradar el conjunto de los compuestos de la matriz extracelular, indispensables para la migración de las células endoteliales. Otras enzimas, que pertenecen a las serinas proteasas, participan asimismo en la migración celular, tal como el activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) cuando está enlazado a su receptor anclado en la superficie membranaria (u-PAR) y la plasmina.

El conjunto de estos medicamentos tiene como objetivo bloquear la angiogénesis, pero su acción se limita a una o dos etapas de este proceso al contrario del AMEP que es pluripotente. Así, el AMEP bloquea no sólo el conjunto de las funciones angiogénicas de la integrina alfa v beta 3, contra la cual está dirigido inicialmente, a saber la proliferación y la adhesión de las células endoteliales, sino que, de manera sorprendente, induce asimismo una inhibición completa de la migración de estas células así como una inhibición de la formación de estructura de tipo capilar. Su efecto proapoptótico sobre estas células, independiente de una modificación de su ciclo celular, constituye asimismo su originalidad.

Además, de manera inesperada, el AMEP posee al mismo tiempo unas capacidades anti-invasivas y antimetastásicas importantes.

Las adamalisinas, denominadas asimismo ADAM, por "a disintegrin and metalloprotein" o MDC por "metalloproteinrich, disintegrin-rich and cystein-rich protein" son una familia de proteínas ancladas en la membrana plásmica de las células. La estructura común al conjunto de las 29 adamalisinas descritas se compone:

- de un dominio metaloproteinasa cuya actividad catalítica proteásica depende del zinc, -un dominio desintegrina, y -un dominio rico en cisteína y en repetición de tipo EGF (Wolfsberg et al., 1995).

Conviene sin embargo observar que sobre el conjunto de las adamalisinas, sólo una decena tienen un dominio metaloproteinasa que posee una actividad catalítica. El papel fisiológico de las diferentes adamalisinas es extremadamente variado: regulación de la adherencia celular, liberación de un ligando, activación de un receptor, fusión de células (para revisión, Primakoff y Myles, 2000). Sin embargo, no se conoce el modo de acción de estas moléculas.

El AMEP se debe diferenciar de las desintegrinas de serpiente que han sido descritas en la bibliografía bajo dos aspectos:

- Las desintegrinas de serpiente ejercen una acción limitada sobre las diferentes etapas de la angiogénesis. La acutina (Yeh et al., 1998) por ejemplo inhibe la adhesión de las células endoteliales a diferentes compuestos de la matriz e induce su apoptosis mientras que la Salmosina (Kang et al., 1999) induce una inhibición de la adhesión de las células endoteliales y de su proliferación inducida por el FGF2.

- El AMEP presenta asimismo la ventaja de ser de origen humano y por consiguiente, no tiene el carácter

antigénico de las desintegrinas de serpiente que presentan un carácter inmunógeno que les impide ser utilizadas

como medicamentos en un tratamiento a largo plazo requerido en terapia anticancerígena.

La invención tiene por lo tanto por objeto una molécula de ácido nucleico que comprende o que está constituida por una secuencia polinucleotídica que codifica el dominio desintegrina de la Metargidina o un derivado de éste como agente anti-angiogénico, anti-invasivo... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico que comprende o que está constituida por una secuencia polinucleotídica que codifica

el dominio desintegrina de la metargidina o un derivado de éste para una utilización como agente anti-angiogénico, 5 anti-invasivo o anti-metastásico, en la que dicho derivado del dominio desintegrina de la metargidina:

- presenta unas propiedades anti-angiogénicas, anti-invasivas y antimetastásicas; y -está constituido por una secuencia modificada por deleción, adición o sustitución de un aminoácido del dominio desintegrina de la metargidina. 10

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio desintegrina de la metargidina corresponde a la secuencia SEC ID nº 1.

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque se une a un vector plasmídico de 15 expresión.

4. Célula transformada por la molécula de ácido nucleico tal como la definida en una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque expresa el dominio desintegrina de la metargidina o un derivado de éste.

5. Molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su utilización para el tratamiento y/o la prevención de patologías seleccionadas de entre los cánceres, los procesos metastásicos, las enfermedades inflamatorias, la soriasis, la ateroesclerosis y la degenerescencia macular.