INMUNOTOXINAS ANTI-CD64-ETA¿RECOMBINANTES.

Un complejo recombinante que tiene al menos un componente A, al menos un componente B,

comprendiendo el componente A dos o más dominios de unión para el receptor de superficie celular CD64 y siendo el componente B un dominio de destrucción de células en el que el complejo es el complejo recombinante monovalente m22(scFv)2-ETA' (SEC ID Nº: 8) o el complejo bivalente m22(scFv) 2-ETA' (SEC ID Nº: 8)

Campo Técnico

La presente invención se refiere, en general, al tratamiento de enfermedades que implican CD64 y, más específicamente, a la preparación y uso de complejos recombinantes que contienen ligandos específicos de CD64, que inducen la internalización del complejo después de la unión, y también a agentes citotóxicos para alterar la función, expresión génica o viabilidad de una célula de un modo terapéutico.

Antecedentes de la invención

Los medicamentos disponibles actualmente para el tratamiento de una amplia diversidad de enfermedades, tales como agentes quimioterapéuticos, corticoesteroides y agentes inmunosupresores inespecíficos, tienen la desventaja de inducir potencialmente cierta lesión general, debido a su no especificidad relativa. Se ha intentado moderar esto mediante diversos conceptos terapéuticos. Una estrategia alternativa es el uso de agentes inmunoterapéuticos para aumentar la especificidad de los medicamentos. Esta estrategia se ha descrito especialmente para el tratamiento de tumores.

Si el agente inmunoterapéutico es una inmunotoxina, entonces un anticuerpo monoclonal (Acmo) o un fragmento de anticuerpo, que tiene una afinidad específica, por ejemplo, por marcadores de superficie de células tumorales, se acopla a un reactivo citotóxico. Como reactivos citotóxicos se han usado toxinas y radiactividad. Se consiguió un efecto terapéutico directo sobre las células diana con anticuerpos unidos a elementos radiactivos o toxinas para formar los denominados radioinmunoconjugados o inmunotoxinas (IT). Cuando se usaron Acmo anti-linfocitos B marcados radiactivamente con linfomas de linfocitos B se observaron regresiones del tumor e incluso remisiones completas (1). Por el contrario, los resultados con Acmo contra tumores sólidos fueron más bien desilusionantes. El tamaño relativamente grande de las IT usadas en estos estudios parece interferir con su capacidad de penetrar en los tumores y convierte las mismas en productos terapéuticos ineficaces. La baja tasa de penetración en tumor planteó un problema desafiante particular para tumores mal vascularizados. Para obtener una mejor penetración tisular y en tumor y en general propiedades de difusión mejoradas se miniaturizaron las IT. También se especuló que estas IT más pequeñas serían menos inmunógenas debido al tamaño reducido de los determinantes antigénicos (2). Por lo tanto, se conjugaron fragmentos de anticuerpo escindidos proteolíticamente (miniaturizados) con las funciones efectoras que se han mencionado anteriormente (elementos radiactivos o toxinas).

Las técnicas de clonación mejoradas permitieron la preparación de IT completamente recombinantes: regiones codificantes de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina, amplificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa, se unieron entre sí mediante un engarce sintético, por ejemplo, (Gly4Ser)3. Después, el fragmento de cadena sencilla resultante de genes de región variable (scFv) se fusionó genéticamente con una región codificante de una enzima catalíticamente activa incluyendo proteínas o polipéptidos citotóxicamente activos (3).

Los venenos celulares peptídicos que se han usado más frecuentemente hasta la fecha y, por lo tanto, mejor caracterizados, son las toxinas bacterianas toxina de la difteria (DT), exotoxina A de Pseudomonas (PE) y la Ricina A procedente de planta (4) El mecanismo de la actividad citotóxica es esencialmente el mismo en todas estas toxinas a pesar de sus diferentes fondos evolutivos. El dominio catalítico inhibe la biosíntesis de la proteína mediante modificación directa del factor de elongación 2 (EF-2), que es importante para la traducción, o mediante la inactivación del sitio de unión a EF-2 en la subunidad 28S-ARNr de ribosomas.

En la mayoría de las construcciones empleadas hasta la fecha, la aplicación sistémica de inmunotoxinas da como resultado efectos secundarios más o menos graves. Además del síndrome de la “permeabilidad vascular” también tienen lugar trombocitopenia, hemólisis, insuficiencia renal y náuseas, dependiendo de la construcción empleada y la dosificación aplicada (4). También se observó lesión hepática dependiente de la dosis (5). Además de los efectos secundarios documentados, la inmunogenicidad de las construcciones es uno de los problemas clave de la inmunoterapia. Esto se aplica, en particular, a la defensa humoral contra los dominios catalíticos empleados, tales como ricina (HARA), PE o DT (2). En teoría, todas las estructuras no humanas pueden provocar una respuesta inmune. Por tanto, la administración repetida de inmunotoxinas e inmunoconjugados está limitada. Una consecuencia lógica de estos problemas es el desarrollo de inmunotoxinas humanas.

Hasta la fecha, las toxinas humanas usadas en inmunotoxinas se han seleccionado en la mayoría de los casos de ribonucleasas (6). Ya que las ARNasas humanas están presentes en líquidos extracelulares, plasma y tejidos, se consideran menos inmunógenas cuando se usan en inmunotoxinas. La angiogenina (ANG), una proteína de 14 kDa que tiene una homología de secuencia del 64% con la ARNasa A, se aisló por primera vez de un medio acondicionado para células tumorales, donde se descubrió debido a su capacidad de inducir la angiogénesis (7). Se mostró que la actividad de ARNasa específica de ARN-t de la Angiogenina tiene un potencial citotóxico. De acuerdo con esto, las inmunotoxinas conjugadas químicamente mostraron posteriormente una actividad tóxica específica de células. Para evaluar la eficacia de inmunotoxinas basada en ANG se construyeron diferentes conformaciones de ANG con, por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF) o ligando CD30 y se ensayaron exitosamente in vitro (8). Otro miembro de la superfamilia de ARNasa es la neurotoxina eosinofílica (EDN). Para la EDN, que tiene un tamaño de 18,4 kDa, solamente se ha descrito la neurotoxicidad directa hasta la fecha. Basándose en la potencia documentada se han construido diferentes inmunotoxinas basadas en EDN y se han ensayado exitosamente in vitro (9).

Muy recientemente se mostró que proteasas tales como granzima B o derivados de la misma pueden cumplir eficazmente la función efectora de inmunotoxinas (documento PCT/EP01/04514).

La CD64 es una glucoproteína de superficie celular de 72 kDa que se expresa normalmente en monocitos/macrófagos y células dendríticas (10). Las funciones biológicas medidas por este receptor incluyen producción de superóxido y citocina (TNF-, IL-1, IL-6), citotoxicidad, endocitosis/fagocitosis y soporte de presentación de antígenos. Este receptor representa una diana apropiada para inmunoterapia de tumores malignos hematológicos debido a que no está presente en células madre, garantizando de este modo la regeneración de células efectoras inmunes positivas a CD64 normales (11).

El objetivo final en el tratamiento de pacientes con cáncer es la eliminación de cada célula tumoral. Los pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) tiene un total de 1012 a 1013 células malignas en el momento del diagnóstico. Por definición se consigue la remisión completa después de la terapia tan pronto como sean detectables menos del 5% de células malignas en la médula ósea. Sin embargo, estos pacientes todavía pueden llevar hasta 1010 célula malignas en el torrente sanguíneo en ese momento. Estas células residuales mínimas clínicamente no identificables son la causa más común de recidiva (12). A pesar de los avances en la poliquimio- y radioterapia sólo aproximadamente el 20%30% de los pacientes con AML consiguen la supervivencia sin enfermedad a largo plazo después de la terapia de primera línea. Por tanto, la eliminación de enfermedad residual mínima (MRD) puede mejorar el resultado de pacientes con AML. Las estrategias selectivas, que incluyen terapias basadas en anticuerpos, que dirigen agentes citotóxicos a estas células, pueden ofrecer una herramienta prometedora para la eliminación específica de MRD. Para mejorar la actividad antitumoral de anticuerpos nativos se han conjugado fármacos, isótopos y toxinas con anticuerpos monoclonales (13).

Recientemente, una inmunotoxina anti-CD64 unida químicamente mostró una unión rápida a e internalización eficaz en células de leucemia positivas a CD64 in vitro e in vivo (14). Los autores documentaron la regresión rápida del tumor de masas tumorales que variaban del 85% a > 90% en un modelo de AML humana en ratones NOD/SCID. El obstáculo principal observado en este y otros experimentos fueron toxicidades inespecíficas, relacionadas principalmente con... [Seguir leyendo]

1. Un complejo recombinante que tiene al menos un componente A, al menos un componente B, comprendiendo el componente A dos o más dominios de unión para el receptor de superficie celular CD64 y siendo el componente B un dominio de destrucción de células en el que el complejo es el complejo recombinante monovalente m22(scFv)2-ETA' (SEC ID Nº: 8) o el complejo bivalente m22(scFv)2-ETA' (SEC ID Nº: 8).

2. Moléculas de ácido nucleico que codifican el complejo recombinante diseñado de acuerdo con la reivindicación 1 para el complejo completo.

3. Vectores que comprenden una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.

4. Células diferentes de las células madre embrionarias humanas u organismos no humanos que sintetizan el complejo recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, que se pueden obtener transformando o transfectando las mismas con moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 2 o vectores de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Los organismos o células de acuerdo con la reivindicación 4, en los que los organismos son procariotas, tales como E. coli, B. subtilis, S. carnosus, S. coelicolor o Marinococcus sp., eucariotas inferiores, tales como Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Spodoptera sp. o P. pastoris.

6. Medicamento que comprende un complejo de acuerdo con la reivindicación 1, moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, vectores de acuerdo con la reivindicación 3, células aisladas y/o extractos de las mismas de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, organismo unicelular, tal como procariotas y eucariotas inferiores o extractos de los organismos de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5.

7. Uso del complejo de acuerdo con la reivindicación 1 y/o de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 y/o los vectores de acuerdo con la reivindicación 3 en la fabricación de un medicamento para influir en el crecimiento celular y la fisiología de células CD64+.

8. Uso del complejo de acuerdo con la reivindicación 1, o de las moléculas de ácido nucleico que codifican el mismo de acuerdo con la reivindicación 2, o de los vectores de acuerdo con la reivindicación 3 y/o de células u organismos de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leucemia mieloide aguda, reacciones de inflamación crónica, tales como enfisema, asma intrínseca y extrínseca, dermatitis atópica, erupción polimorfa lumínica, LES, injerto contra huésped, esclerosis múltiple, síndrome de activación de macrófagos, artritis reumatoide, artritis juvenil, enfermedad de Crohn y enfermedad intestinal crónica.

9. Un procedimiento para producir el complejo recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las siguientes etapas:

(a) transformar/transfectar células diferentes de células madre embrionarias humanas, microorganismos tales como bacterias, hongos y/o ciliados con las moléculas de ácido nucleico o vectores de acuerdo con la reivindicación 2 y/o 3;

(b) cultivar las células, microorganismos y/u organismos de la etapa (a) en condiciones adecuadas para la expresión génica y síntesis proteica para acumular el complejo recombinante intracelularmente

o en el medio de cultivo circundante; y

(c) aislar y purificar el complejo recombinante de la etapa (b).