PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE PEQUEÑAS PARTÍCULAS DE TEJIDO VIABLES Y SU USO PARA LA REPARACIÓN TISULAR.

Procedimiento de obtención de pequeñas partículas de tejido viables y su uso para la reparación tisular. CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La preparación y el uso de partículas de tejido fragmentadas a partir de diversas fuentes para la reparación de defectos tisulares, como los defectos tisulares del aparato locomotor. ANTECEDENTES El cartílago articular es una superficie fina, suave, de baja fricción y deslizante, compuesta de cartílago hialino, resistente a fuerzas de compresión. Aunque solamente tiene un espesor de pocos milímetros, presenta unas excelentes características de desgaste. Su capacidad mecánica y estructural depende de la integridad de su matriz extracelular, en la que los condrocitos están distribuidos de forma dispersa entre macromoléculas estructurales, como colágeno, proteoglucanos y proteínas no colágenas. Aunque las células condrocíticas producen la matriz extracelular, componen menos del 5% del peso húmedo del cartílago. La composición y la interacción de estos componentes, de gran complejidad, hacen que las técnicas de 20 regeneración y sustitución sean problemáticas. Por ejemplo, la ausencia de un suministro sanguíneo directo y las pocas células distribuidas ampliamente entre una densa matriz extracelular conducen a una capacidad de curación limitada del cartílago articular dañado. Esto ha llevado a una amplia diversidad de enfoques de tratamientos para defectos, por ejemplo, en la rodilla, con distintos grados de éxito. 25 Los procedimientos tales como perforación, abrasión, microfractura y desbridamiento proporcionan un alivio sintomático del dolor y mejoran la funcionalidad. Puede hacerse referencia a estos procedimientos colectivamente como técnicas de estimulación de la médula ósea subcondral, en las que se hace sangrar al hueso situado bajo el cartílago, que tiene abundante suministro sanguíneo. El objetivo de estos procedimientos es la movilización de células madre mesenquimáticas de la sangre para su diferenciación en células similares a condrocitos que sinteticen 30 el tejido de reparación. Una vez que se rompe el hueso esponjoso vascularizado, se forma un coágulo de fibrina y células pluripotentes migran a la zona. Eventualmente, estas células se diferencian en células similares a condrocitos que segregan colágeno del tipo I, del tipo II y de otros tipos, así como proteoglucanos específicos del cartílago, después de recibir las señales mecánicas y biológicas apropiadas. Las células producen un tejido fibroblástico de reparación que, en apariencia y en una biopsia inicial, puede ser de tipo hialino, pero que, con el 35 tiempo, se demuestra histológicamente que se trata predominantemente de tejido fibrocartilaginoso. El fibrocartílago es una red relativamente desorganizada de fibras de colágeno, a diferencia del cartílago hialino natural y, por lo tanto, rellena parcialmente el defecto con un tejido estructuralmente débil que también presenta una durabilidad limitada. 40 Otros procedimientos opcionales como el injerto perióstico, los autoinjertos y aloinjertos osteocondrales y el autoimplante de células condrocíticas se han usado para la reparación de defectos de cartílago con el propósito de reducir el dolor y restablecer la funcionalidad. En general, el éxito de estos procedimientos disminuye con el tiempo, posiblemente debido a la formación de fibrocartílago, un desarrollo inadecuado del tejido de reparación, escasa diferenciación celular y/o escasa unión a los bordes del cartílago articular circundante. Los injertos de espesor total 45 intactos, como los autoinjertos y aloinjertos osteocondrales pueden fracasar también a causa de tamaños dispares, rechazo inmunológico y escasa adhesión del cartílago a las superficies óseas. Para el autoimplante de células condrocíticas se necesitan dos intervenciones quirúrgicas: primeramente, los condrocitos se obtienen de un área de cartílago no involucrada y se cultivan durante 14 a 21 días y después, las células cultivadas se inyectan en el defecto expuesto por medio de una incisión abierta y se cubren con un colgajo perióstico extirpado de la tibia medial 50 proximal.   Se han sugerido diversos procedimientos para promover el crecimiento y la reparación tisular, y en particular, la reparación de cartílago, que incluyen el uso de partículas de tejido derivadas de la trituración de cartílago articular no desmineralizado en piezas de aproximadamente 60 µm a aproximadamente 500 µm (Malinin, solicitud de patente de los EE. UU. n° 20050196460); el picado del tejido en partículas mediante dos cuchillas paralelas, lo que da lugar a partículas de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 mm 3 de tamaño que contienen al menos una célula viable (Binette y col., solicitud de patente de los EE. UU. n° 20040078090); la pulverización de tejido blando en pedazos de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 µm que pueden combinarse con elementos (células) viables y/o moléculas bioactivas (Awad y col., solicitud de patente de los EE. UU. n° 20050288796); y la molienda de cartílago de aloinjerto que se liofiliza después para crear partículas de un tamaño de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 1 mm que pueden formularse en una pasta (Gomes y col., solicitud de patente de los EE. UU. n° 20040219182). También se han desvelado diversos procedimientos de preparación de tejidos, incluido un procedimiento para generar piezas de tejido dérmico de aproximadamente 50 µm a aproximadamente 1.500 µm mediante un rodillo con cuchillas múltiples (Mishra y col., solicitud de patente de los EE. UU. n° 20040175690). 2 La viabilidad de las células y/o los tejidos para implantes necesita mejorarse. Por ejemplo, con los homogeneizadores usados para generar las partículas de tejido, aproximadamente el 5% de las células permanece viable después de la homogeneización. La digestión enzimática, que se usa con frecuencia para generar células para el autotrasplante de células condrocíticas, resulta en una escasa viabilidad de las células después del aislamiento inicial. Son de desear composiciones y procedimientos mejorados para la reparación de defectos tisulares y, en particular, defectos del cartílago articular. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Una realización es una composición que incluye pequeñas partículas de tejido aisladas, compuestas de células y de sus moléculas extracelulares asociadas (por ejemplo, proteínas, polisacáridos, proteoglucanos, etc.), conocidas como la matriz extracelular (MEC). Las partículas de tejido se fragmentan de modo que en algunas realizaciones dichas partículas tienen al menos una dimensión inferior a aproximadamente 60 µm. En otra realización, las partículas tienen al menos una dimensión inferior a aproximadamente 1 mm. En otra realización, las partículas se fragmentan de modo que su volumen es inferior a aproximadamente 1 mm 3 . En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 50% de las células en las partículas de tejido es viable. En otras realizaciones, al menos el 80% de las células en las partículas de tejido es viable. En algunas realizaciones, la composición puede contener también aditivos como adhesivos, disoluciones y agentes bioactivos. Algunos ejemplos de adhesivos incluyen cola de fibrina, Tisseal (Baxter BioScience, Deerfield IL, EE. UU.) y Surgicel (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, EE. UU.). Algunos ejemplos de agentes bioactivos incluyen fibrinógeno, trombina, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), factores de crecimiento transformantes (TGF), incluida la forma ß (TGFß), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) y aspirado de médula ósea. Otra realización es un procedimiento para la creación de pequeñas partículas de tejido, en el que una muestra de tejido se pone en un dispositivo de corte que contiene al menos dos cuchillas en paralelo en una realización y al menos tres cuchillas en paralelo en otra realización. En las realizaciones que contienen al menos tres cuchillas, el espaciamiento entre las cuchillas puede ser uniforme o variable. El espaciamiento entre las cuchillas puede definir una dimensión de la partícula. En una realización, al menos una de las cuchillas es curva. En otra realización, al menos dos de las cuchillas no son paralelas. En una realización, el aparato de fragmentación comprende al menos tres cuchillas montadas en paralelo y separadas por espaciadores con una anchura de aproximadamente 60 µm. Cambiando la relación espacial relativa entre la muestra de tejido y el aparato de corte, pueden hacerse cortes en los planos horizontal, vertical y frontal. Dado que el ángulo entre estos planos puede variarse, las partículas de tejido resultantes pueden fragmentarse con diversas formas, como cubos, triángulos, cuadriláteros y otros polígonos. Otra realización son las composiciones... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una pluralidad de partículas de tejido aisladas viables, en que las partículas comprenden células con al menos el 80% de viabilidad y proteínas extracelulares asociadas a las células, en que cada partícula ha sido fragmentada para tener al menos una dimensión inferior a 60 µm. 2. La composición de la reivindicación 1, en que las proteínas extracelulares son un componente de una matriz extracelular. 10 3. La composición de la reivindicación 2, en que las proteínas extracelulares se seleccionan del grupo que consta de colágeno, elastina, fibrilina, fibronectina y laminina. 4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que las partículas comprenden tejido seleccionado del grupo que consta de cartílago, hueso, ligamento, menisco, tendón, músculo y combinaciones de los mismos. 5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que las partículas comprenden tejido manipulado. 20 6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que las partículas comprenden tejido juvenil.   7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que las partículas comprenden cartílago articular. 8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el cartílago articular comprende al menos uno de cartílago hialino o fibrocartílago. 9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende al menos un adhesivo, un tampón o un agente bioactivo. 10. La composición de la reivindicación 9, en que el adhesivo se selecciona del grupo compuesto por fibrina, ácido hialurónico, cola de fibrina, coágulo de fibrina, gel de colágeno, gel de alginato, adhesivo de gelatina, resorcina y formaldehido, adhesivo a base de moluscos, adhesivo a base de dihidroxifenilalanina (DOPA), quitosano, transglutaminasa, adhesivo a base de poli(aminoácidos), adhesivo a base de celulosa, adhesivo a base de polisacáridos, adhesivos sintéticos a base de acrilato, plasma rico en plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), coágulo de PRP, coágulo de PPP, los copolímeros monoestearilglicerol-co-succinato (MGSA) y monoestearilglicerol-co-succinato/polietilenglicol (MGSA/PEG), laminina, elastina, proteoglucanos y combinaciones de los mismos. 11. La composición de la reivindicación 9, en que el agente bioactivo se selecciona del grupo que consta de factores de crecimiento hormonas, nutrientes, BMP, IGF, TGF, PDGF y aspirado de médula ósea. 12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende trombina. 13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la mejora de un tejido dañado en un mamífero. 14. La composición para el uso según la reivindicación 13, en que el tejido dañado se selecciona del grupo que consta de cartílago, hueso, ligamento, menisco, tendón, músculo y combinaciones de los mismos. 15. La composición para el uso según la reivindicación 14, en que el tejido dañado es cartílago articular. 9     11   % VIABILIDAD EN EL PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE LAS PARTÍCULAS 12   13   14