Procedimiento para la generación de un mapa físico de por lo menos una parte de un genoma que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra ADN; (b) generar un banco de clones de un cromosoma artificial (BAC, YAC) en el que cada clon de un cromosoma artificial; (c) combinar los clones de cromosomas artificiales en uno o más agrupaciones, en los que cada clon se encuentra presente en más de una agrupación, para crear una genoteca; (d) digerir el ADN de una o más agrupaciones con una o más endonucleasas de restricción para proporcionar un conjunto de fragmentos de restricción para cada agrupación; (e) ligar los adaptadores a uno o ambos lados de los fragmentos de restricción, en los que por lo menos un adaptador contiene un identificador específico de la agrupación o una sección redundante del identificador, respectivamente, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador; (f) opcionalmente, combinar los fragmentos de restricción ligados al adaptador; (g) opcionalmente, amplificar los fragmentos de restricción ligados al adaptador de etapa (e) con por lo menos un cebador, comprendiendo dicho cebador una sección específica de la agrupación que corresponde a la sección del identificador específica de la agrupación en el adaptador o comprendiendo un identificador específico de la agrupación en la posición de la sección redundante del identificador, respectivamente, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador amplificados etiquetados (amplicones); (h) opcionalmente, combinar los amplicones en un conjunto de amplicones combinados; (i) determinar la secuencia de por lo menos el identificador específico de la agrupación y una parte del fragmento de restricción de los fragmentos de restricción ligados al adaptador, de los amplicones o conjunto de amplicones combinados; (j) asignar las secuencias de fragmentos de restricción determinadas en los fragmentos de restricción ligados al adaptador o amplicones de la etapa (i) a los clones correspondientes utilizando los identificadores específicos de la agrupación; (k) construir un cóntigo basado en el emparejamiento de la secuencia de las secciones obtenidas del fragmento de restricción; (l) ordenar los fragmentos de restricción de la etapa (k) para construir de este modo cóntigo del clon y generar un mapa físico

Cartografía física de alto rendimiento utilizando AFLP.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y al de la biotecnología. En particular, la presente invención se refiere al campo de la detección e identificación de ácidos nucleicos. Más particularmente, la presente invención se refiere a la generación de un mapa físico de un genoma, o una parte del mismo, utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento.

Antecedentes de la invención

Los mapas genómicos genéticos y físicos integrados resultan muy valiosos para el aislamiento de genes basándose en la cartografía, análisis comparativos de genomas y como fuentes de clones con la secuencia preparada para proyectos de secuenciación de genomas. El efecto de la disponibilidad de un mapa integrado de marcadores físicos y genéticos de una especie para la investigación del genoma es enorme. Los mapas integrados permiten la realización de una cartografía genética precisa y rápida y una cartografía precisa de locus de microsatélites y marcadores SNP. Se han desarrollado diversos procedimientos para integrar mapas físicos de genomas de complejidad diversa. Uno de los métodos mejor caracterizados utiliza enzimas de restricción para generar un número elevado de fragmentos de ADN a partir de subclones genómicos (Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1989), 86, 8902-8906; Gregory et al., Genome Res. (1997), 7, 1162-1168; Marra et al., Genome Res. (1997), 7, 1072-1084). Se comparan dichas huellas genéticas para identificar clones relacionados y para integrar clones superpuestos en cóntigos. La utilidad de la obtención de la huella genética para ordenar clones insertos grandes de un genoma complejo es limitada, sin embargo, gracias a la variación de la migración del ADN de gel a gel, la presencia de ADN repetitivos, la distribución anómala de sitios de restricción y la representación sesgada de los clones. La mayoría de mapas físicos de calidad elevada de genomas complejos se han realizado, por lo tanto, utilizando una combinación de obtención de la huella genética y procedimientos basados en la PCR o en la hibridación. Sin embargo, una de las desventajas de las que adolece la utilización de la tecnología de la obtención de la huella genética es que se basa en la compatibilidad fragmento - molde, lo que constituye un procedimiento indirecto.

Se prefiere crear mapas físicos generando los cóntigos basándose en los datos de la secuencia real, es decir, un procedimiento más directo. Un mapa físico basado en la secuencia no es únicamente más preciso, sino que al mismo tiempo contribuye asimismo a la determinación de la secuencia genómica entera de la especie de interés. Recientemente se dispone de procedimientos de secuenciación de alto rendimiento que permiten la determinación de secuencias completas de nucleótidos de clones de un modo más eficiente y rentable.

Sin embargo, la detección por secuenciación del fragmento de restricción completo resulta todavía relativamente poco rentable. Además, el estado actual de la tecnología de secuenciación tal como se da a conocer en las publicaciones (de 454 Life Sciences, www.454.com, Solexa, www.solexa.com, y Helicos, www.helicosbio.com), a pesar de su gran potencia en la secuenciación, únicamente puede proporcionar la secuenciación de fragmentos con una longitud limitada. Asimismo, los procedimientos actuales no permiten el procesamiento simultáneo de diversas muestras en una serie.

Constituye el objetivo de la presente invención diseñar y describir una estrategia que permita la generación de alto rendimiento de un mapa físico basado en una combinación de digestión por restricción, agrupación, amplificación de alta precisión y secuenciación de alto rendimiento. Utilizando dicho procedimiento, se pueden generar, mapas físicos, incluso de genomas complejos.

Definiciones

En la descripción y ejemplos siguientes, se utiliza un cierto número de términos. A fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de la presente memoria y reivindicaciones, comprendiendo el alcance a proporcionar a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones. Excepto si se define de otro modo en la presente memoria, todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que les atribuyen habitualmente los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención.

Ácido nucleico: un ácido nucleico según la presente invención puede comprender cualquier polímero u oligómero de bases de pirimidina y purina, preferentemente citosina, timina y uracilo, y adenina y guanina, respectivamente (véase Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry ("Principios de Bioquímica"), en 793-800 (Worth Pub. 1982)). La presente invención contempla cualquier desoxirribonucleótido, ribonucleótido o componente peptídico de un ácido nucleico, y cualquier variante química de los mismos, tales como las formas metiladas, hidroximetiladas o glucosiladas de dichas bases y similares. Los polímeros u oligómeros pueden presentar una composición heterogénea u homogénea, y se pueden aislar a partir de fuentes naturales o se pueden producir artificialmente o sintéticamente. Además, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o una mezcla de los mismos, y pueden existir de un modo permanente o transitorio en forma monocatenaria o bicatenaria, comprendiendo los estados homodúplex, heterodúplex e híbrido.

AFLP: AFLP se refiere a un procedimiento de amplificación selectiva de ácidos nucleicos que se basa en digerir un ácido nucleico con una o más endonucleasas de restricción para proporcionar fragmentos de restricción, ligar adaptadores a los fragmentos de restricción y amplificar los fragmentos de restricción ligados al adaptador con por lo menos un cebador que es (en parte) complementario al adaptador, (en parte) complementario a los restos de la endonucleasa de restricción, y que comprende además por lo menos un nucleótido seleccionado aleatoriamente de entre A, C, T o G (o U si este es el caso). El AFLP no requiere información previa alguna de la secuencia y se puede realizar en cualquier ADN inicial. En general, el AFLP comprende las etapas de:

1. Procedimiento para la generación de un mapa físico de por lo menos una parte de un genoma que comprende las etapas de: