Proteínas N, M y he de torovirus porcino, procedimiento de obtención y sus aplicaciones en diagnóstico y tratamiento de torovirus porcino.

La presente invención describe la capacidad inmunogénica de las proteínas N, M y HE de torovirus porcino, y el empleo de las mismas para el desarrollo de procedimientos de diagnóstico inmunológico de torovirus porcino así como para la elaboración de anticuerpos específicos. Por otro lado, estas proteínas pueden utilizarse para la elaboración de vacunas dirigidas a la prevención de esta enfermedad en cerdos

Proteínas N, M y HE de torovirus porcino, procedimiento de obtención y sus aplicaciones en diagnóstico y tratamiento de torovirus porcino.

Sector de la técnica

Este invento podría tener aplicación en el sector ganadero y en particular, con utilidad para el diagnóstico y tratamiento veterinario, mediante herramientas biotecnológicas de tipo inmunológico y vacunas, respectivamente, especialmente para el diagnóstico y tratamiento de torovirus porcino.

Estado de la técnica

Los torovirus pertenecen a la familia Coronaviridae, del orden Nidovirales. Son virus emergentes causantes de gastroenteritis en caballos, terneras, cerdos y humanos, de los que apenas se tiene información. Esta situación es debida a que los torovirus a excepción del aislado equino BEV, no han sido adaptados al cultivo in vitro, lo que ha retrasado el desarrollo de herramientas para su diagnóstico y para su estudio. Los estudios iniciales sobre torovirus se llevaron a cabo mediante microscopía electrónica y mediante esta técnica se describió la existencia de torovirus equino (BEV), bovino (BToV) (Woode y col., 1982), humano (HToV) (Beards y col., 1984) y porcino (PToV) (Scott y col., 1987). Sin embargo, fue a partir de la adaptación al cultivo in vitro de BEV (Weiss y col., 1983), y el desarrollo de infecciones experimentales con BToV en terneras (Woode y col., 1982), cuando se inició el desarrollo de herramientas para el estudio de los torovirus. Así, basándose en el genoma de BEV, pues era el único del que se disponía de información, se han utilizado para la detección de torovirus sistemas de RT-PCR (Koopmans y col., 1991; Duckmanton y col., 1998) así como hibridación con sondas basadas en la secuencia de BEV (Koopmans y col., 1991). También se han utilizado para diagnóstico métodos de ELISA, especialmente para BToV (Brown y col., 1987; Woode, 1987; Durham y col., 1989; Koopmans y col., 1989; Koopmans y col., 1991; Liebler y col., 1992) y HToV (Koopmans y col., 1993; Koopmans y col., 1997). Los escasos trabajos realizados sobre PToV corresponden a estudios llevados a cabo mediante microscopía electrónica (Scott y col., 1987; Durham y col., 1989; Penrith y Gerdes, 1992) o mediante estudios serológicos utilizando BEV como antígeno. Hasta la fecha, la detección de anticuerpos frente a torovirus porcino se ha llevado a cabo mediante ensayos de neutralización de la infectividad de BEV y mediante ELISA frente a BEV (Brown y col., 1988; Liebermann, 1990). Estos métodos presentan varios inconvenientes, uno de ellos relacionado con la dificultad de la obtención de virus, que requiere un gran esfuerzo tanto económico como del personal de laboratorio. Por otra parte, para el ensayo de neutralización es necesaria además la utilización de cultivos celulares, algo que habitualmente no se lleva a cabo en el diagnóstico veterinario y que está reservado al diagnóstico en humanos. Además, este ensayo es laborioso y lento ya que se requieren varios días para obtener el resultado. Por otra parte, a pesar de que las distintas especies de torovirus están serológicamente relacionadas esta reactividad cruzada no es total, por lo que sistemas de diagnóstico basados en esta reactividad pueden producir un mayor porcentaje de falsos negativos.

La evidencia molecular de la existencia de PToV no se obtuvo hasta 1998 (Kroneman y col., 1998). En ese mismo trabajo se observó una elevada prevalencia de anticuerpos frente al virus mediante ensayos de neutralización del virus BEV. Hasta la fecha los únicos métodos de diagnóstico de torovirus que se utilizan (en investigación y/o comercializados) son específicos para las formas del virus que afectan al ganado equino y bovino:

- ELISA para la detección de anticuerpos frente a torovirus usando el virus equino BEV como antígeno

- ELISA para la detección de anticuerpos frente a torovirus usando el virus bovino BRV como antígeno

- Ensayo de neutralización de la infectividad de BEV para la detección de anticuerpos frente a torovirus

- Proteína N del torovirus bovino BRV expresada en E. coli en westernblot para detectar anticuerpos frente a torovirus en sueros de terneras infectadas con BRV.

- Se ha generado un suero policlonal en cobayas frente a la proteína HE del torovirus bovino BRV expresada en células de insecto mediante un baculovirus recombinante

- Se ha generado un suero policlonal en cobayas frente a la proteína N del torovirus bovino BRV expresada en E. coli, y

- Se ha generado un suero policlonal en conejo frente a un fragmento de la proteína HE de torovirus bovino BRV (aa 35-391).

Sin embargo, y pasado todo este tiempo, no se ha desarrollado y comercializado un sistema de diagnóstico específico de torovirus porcino siendo las únicas alternativas los sistemas anteriormente descritos. Por tanto, la toma de decisiones basada en el diagnóstico con los sistemas descritos puede ser incorrecta, lo que al mismo tiempo provoca que el peligro de infecciones de torovirus porcino no se valore adecuadamente o se infravalore en el sector veterinario y no se promueva una política de control en un sector, el porcino, de gran valor económico. Únicamente, en relación con el torovirus porcino se ha expresado de forma transitoria (pero no se ha purificado) la proteína HE de tres aislados de torovirus porcino, pero en ningún caso se ha demostrado la capacidad antigénica o inmunogénica de estas proteínas (Smits, SL et al. 2003).

Bibliografía

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1. Complejo proteico útil para el diagnóstico y el desarrollo de vacunas frente a torovirus porcino caracterizado porque comprende, al menos, una proteína y/o, un fragmento o péptido de la misma, del siguiente grupo:

i) proteína N de SEQ ID NO: 9,

ii) proteína M de SEQ ID NO: 11, y

iii) proteína HE de SEQ ID NO: 13.

2. Complejo proteico según la reivindicación 1 caracterizado porque está constituido por una única proteína de las pertenecientes al siguiente grupo: proteína de SEQ ID NO: 9, proteína de SEQ ID NO: 11 y proteína de SEQ ID NO: 13.

3. Complejo proteico según la reivindicación 1 caracterizado porque está constituido por una mezcla de las proteínas pertenecientes al siguiente grupo: proteína de SEQ ID NO: 9, proteína de SEQ ID NO: 11 y proteína de SEQ ID NO: 13; preferentemente, un complejo proteico formado por la proteína N y M, o un complejo proteico formando por la proteína N y HE.

4. Complejo proteico según la reivindicación 1 caracterizado porque está constituido por una mezcla de fragmentos o péptidos de las, mismas o distintas, proteínas pertenecientes al siguiente grupo: proteína de SEQ ID NO: 9, proteína de SEQ ID NO: 11 y proteína de SEQ ID NO: 13; preferentemente, un complejo formado por fragmentos de la proteína N o de la proteína HE, preferentemente los péptidos 286E1-HE (SEQ ID NO: 14) y/o 286F1-HE (SEQ ID NO: 16).

5. Procedimiento para la producción de las proteínas de torovirus porcino del complejo proteico según las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque comprende cultivar un microorganismo que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para una o varias de dichas proteínas de torovirus porcino, la expresión y, si se desea, la recuperación de dichas proteínas.

6. Procedimiento según la reivindicación 5 caracterizado porque comprende las etapas de:

a) cultivar células, preferentemente de insecto o de mamífero, transformadas con un sistema de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para, al menos, una proteína de la invención, en donde dicha proteína es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13.

b) si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas proteínas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque comprende la transfección de una célula de insecto con un baculovirus que comprende la secuencia de nucleótidos del gen N (SEQ ID NO: 8).

8. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque comprende la transformación de una célula de mamífero con un virus vaccina que comprende la secuencia de nucleótidos del gen HE (SEQ ID NO: 12).

9. Secuencia de nucleótidos caracterizada porque codifica las proteínas N, M o HE según las reivindicaciones 1 a la 4 útil para la construcción de un vector de expresión y que puede comprender, al menos, una secuencia y/o, un fragmento de la misma, del siguiente grupo:

i) secuencia de nucleótidos N de SEQ ID NO: 8,

ii) secuencia de nucleótidos M de SEQ ID NO: 10, y

iii) secuencia de nucleótidos HE de SEQ ID NO: 12.

10. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9 caracterizada porqué está constituida por una única secuencia de las pertenecientes al siguiente grupo: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12.

11. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9 caracterizada porqué está constituida por una mezcla de las secuencias pertenecientes al siguiente grupo: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12; preferentemente, una mezcla de secuencias formada por la secuencia de nucleótidos N y M (SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10), o más preferentemente, un complejo proteico formando por la secuencia de nucleótidos N y HE (SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 12).

12. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9 caracterizada porque está constituida por una mezcla de las secuencias codificantes de fragmentos de la proteína N o de la proteína HE, preferentemente, los péptidos 286E1-HE (SEQ ID NO: 14) y/o 286F1-HE (SEQ ID NO: 16).

13. Proteína o péptido caracterizado porque es codificada por una secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 9 a la 12.

14. Sistema o vector de expresión útil para transformar células caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 9 a la 12.

15. Sistema según la reivindicación 14 caracterizado porque el sistema de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a una proteína seleccionada entre el siguiente grupo: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13.

16. Célula hospedadora caracterizada porque contiene una secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 9 a la 12.

17. Célula hospedadora según la reivindicación 16 caracterizada porque es una célula de insecto, de mamífero o levadura transformada.

18. Uso de la proteína o péptido según la reivindicación 13 para desarrollar anticuerpos específicos útiles para identificar sueros de animales infectados y para inmunizar animales, en particular, cerdos.

19. Anticuerpo caracterizado porque es específico de una proteína según la reivindicación 13, o específico de un fragmento o péptido de la misma, ya sea monoclonal o policlonal.

20. Anticuerpo según la reivindicación 19 caracterizado porque es específico de una proteína perteneciente al siguiente grupo: proteína N de SEQ ID NO: 9, proteína M de SEQ ID NO: 11 y proteína HE de SEQ ID NO: 13.

21. Anticuerpo según la reivindicación 19 caracterizado porque es específico de un fragmento de una proteína según la reivindicación 13 y perteneciente al siguiente grupo: proteína N de SEQ ID NO: 9, proteína M de SEQ ID NO: 11 y proteína HE de SEQ ID NO: 13, preferentemente un fragmento de la proteína HE, y más preferentemente de los péptidos 286E1 (SEQ ID NO: 14) y 286F1 (SEQ ID NO: 16) correspondientes, respectivamente, a los aminoácidos 50-60 y 150-160 de la proteína HE de la invención.

22. Empleo de un anticuerpo según las reivindicaciones 19 a la 21 en la elaboración de sistema de diagnóstico inmunológico de torovirus porcino que permita la identificación de dichos virus en una muestra biológica.

23. Empleo de un anticuerpo según la reivindicación 22 caracterizado porque el sistema inmunológico pertenece al siguiente grupo: sistema de ELISA, tira de inmunocromatografía o de Western blot, que permita la identificación de dichos virus en una muestra biológica.

24. Sistema de diagnóstico inmunológico de torovirus porcino caracterizado porque comprende una cantidad efectiva de uno o varios anticuerpos según las reivindicaciones 19 a la 21, capaces de interactuar con una proteína de un torovirus porcino.

25. Sistema de diagnóstico inmunológico según la reivindicación 24 caracterizado porque es un ELISA que comprende uno de los anticuerpos de la invención frente a las proteínas N, M y HE, o una mezcla de varios de ellos, preferentemente una mezcla de anticuerpos que reconocen las proteínas N y HE porcinas.

26. Sistema de diagnóstico inmunológico según la reivindicación 24 caracterizado porque es una tira cinematografiara que comprende uno de los anticuerpos de la invención frente a las proteínas N, M y HE, o una mezcla de varios de ellos, preferentemente una mezcla de anticuerpos que reconocen las proteínas N y HE porcinas.

27. Sistema de diagnóstico inmunológico según la reivindicación 24 caracterizado porque es un sistema inmunoblot que comprende uno de los anticuerpos de la invención frente a las proteínas N, M y HE, o una mezcla de varios de ellos, preferentemente una mezcla de anticuerpos que reconocen las proteínas N y HE porcinas.

28. Uso de la proteína o péptido según la reivindicación 13 para desarrollar anticuerpos específicos útiles para identificar sueros de animales infectados y para inmunizar animales, en particular, cerdos.

29. Empleo de la proteína según la reivindicación 13 en la elaboración de un sistema inmunológico de identificación de anticuerpos frente a PToV en muestras de sueros de mamíferos, preferentemente animales, y más preferentemente de cerdo.

30. Empleo de la proteína según la reivindicación 29 caracterizado porque el sistema pertenece al siguiente grupo: sistema de ELISA, tira de inmunocromatografía o de Western blot, que permite la identificación conjunta y simultánea de anticuerpos frente a dichas proteínas presentes en una muestra biológica de cerdos.

31. Empleo según la reivindicación 30 caracterizado porque la muestra biológica pertenece al siguiente grupo: suero, plasma o sangre de un animal sospechoso de padecer o haber padecido una infección por torovirus porcino, preferentemente un cerdo.

32. Sistema de diagnóstico inmunológico de torovirus porcino caracterizado porque comprende una cantidad efectiva de una o varias proteínas según la reivindicación 13, capaces de interactuar con anticuerpos anti-torovirus porcino.

33. Sistema de diagnóstico inmunológico según la reivindicación 32 caracterizado porque es un ELISA que comprende una de las proteínas de la invención N, M y HE, o una mezcla de varias de ellas, preferentemente una mezcla de N y HE.

34. Sistema de diagnóstico inmunológico según la reivindicación 32 caracterizado porque es una tira inmunocromatográfica que comprende una de las proteínas de la invención N, M y HE, o una mezcla de varias de ellas, preferentemente una mezcla de N y HE.

35. Sistema de diagnóstico inmunológico según la reivindicación 32 caracterizado porque es un sistema inmunoblot que comprende una de las proteínas de la invención N, M y HE, o una mezcla de varias de ellas, preferentemente una mezcla de N y HE.

36. Uso de la proteína o péptido según la reivindicación 13 en la elaboración de una vacuna destinada a conferir protección a animales, en particular, cerdos, frente a infecciones de torovirus porcino.

37. Vacuna frente torovirus porcino útil para proteger animales, en particular, cerdos, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una o varias proteínas según la reivindicación 13, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

38. Vacuna frente torovirus porcino útil para proteger animales, en particular, cerdos, caracterizada porque comprende un virus vaccina que comprende a su vez, al menos una, las secuencias de nucleótidos de los genes N, M y HE (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12).

39. Sistema de diagnóstico de torovirus porcino a partir de una muestra biológica mediante la identificación de material genómico específico de torovirus porcino caracterizado porque comprende la identificación de los genes N, M y HE, de secuencias SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, respectivamente.

40. Procedimiento de identificación genómica según la reivindicación 39 caracterizado porque se basa en la amplificación de DNA y porque comprende las siguientes etapas:

41. Oligonucleótidos o cebadores útiles para la amplificación por PCR según la reivindicación 40 ii) constituidos por parejas caracterizados porque pertenecen al siguiente grupo:

42. Procedimiento de identificación genómica según la reivindicación 39 caracterizado porque se basa en la técnica de Northern blot mediante sondas de polinucleótidos específicas de los genes N, M y HE, de secuencias SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, respectivamente.