Un método de identificación de un polipéptido celular al que se une un polipéptido vírico,

que comprende: a) identificar en el genoma de un virus, usando la bioinformática, una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido vírico, en el que el polipéptido vírico exhibe al menos un rasgo de virulencia; b) producir una proteína de fusión que comprende el polipéptido vírico fusionado con un marcador de afinidad, en el que el marcador de afinidad comprende un primer marcador polipeptídico y un segundo marcador polipeptídico; c) posteriormente a la etapa (b), poner en contacto una pluralidad de células, o una fracción o un sobrenadante de las mismas, y la proteína de fusión que comprende el polipéptido vírico fusionado con un marcador de afinidad, en condiciones y durante un periodo suficiente que permita al resto polipeptídico vírico de la proteína de fusión interaccionar con un polipéptido asociado a la pluralidad de células, o fracción o sobrenadante de las mismas, proporcionando una proteína de fusión: complejo polipeptídico celular, en el que el polipéptido vírico exhibe al menos un rasgo de virulencia; d) aislar el complejo de proteína de fusión: polipéptido celular mediante purificación por afinidad en tándem; y e) determinar la secuencia aminoacídica del polipéptido celular, o de al menos un fragmento del polipéptido celular que comprende al menos 8 aminoácidos, e identificar así un polipéptido celular al que se une un polipéptido vírico

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La presente invención proporciona un método para identificar polipéptidos celulares en que, cuando se altera una actividad biológica del polipéptido celular, 5 puede tratarse una enfermedad o trastorno, en particular una enfermedad o trastorno inmunitario. El método comprende identificar un factor de virulencia vírica y su diana o dianas celulares: se proporcionan también en la presente memoria métodos para identificar dichos agentes que afectan a la actividad biológica de la diana celular y que pueden usarse como moléculas terapéuticas para tratar una enfermedad o trastorno. 10 Dichos agentes son útiles para alterar la inmunosensibilidad del sistema inmunitario y para tratar trastornos inmunitarios en un sujeto.

Descripción de la técnica relacionada

Las enfermedades y trastornos inmunitarios, incluyendo enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias, aquejan a más de 20 millones de 15 personas en los Estados Unidos. Muchas enfermedades inmunitarias son debilitantes y crónicas, y por tanto afectan a la productividad y bienestar del paciente, así como a su salud general.

Existe la necesidad de identificar polipéptidos celulares que sean efectores o moduladores de una respuesta inmunitaria y también de identificar agentes que 20 modulen la respuesta inmunitaria interaccionando con los polipéptidos celulares. Dichos agentes son útiles para tratar y/o prevenir enfermedades y trastornos inmunitarios y otras enfermedades y trastornos relacionados. Se proporcionan en la presente memoria métodos para identificar polipéptidos celulares que son útiles como dianas terapéuticas. 25

El documento WO2005/002526 se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o trastornos asociados a infección vírica. En consecuencia, se proporcionan las secuencias nucleotídica y aminoacídica de una proteína Brd4 humana. Se proporcionan también complejos que comprenden Brd4 y una proteína E2 o un equivalente funcional de una proteína E2. 30

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona:

Realización ("E") 1. Un método de identificación de un polipéptido celular al que se une un polipéptido vírico, que comprende:

a) identificar en el genoma de un virus, usando la bioinformática, una secuencia 35 polinucleotídica que codifica un polipéptido vírico, en el que el polipéptido vírico exhibe al menos un rasgo de virulencia;

b) producir una proteína de fusión que comprende el polipéptido vírico fusionado con un marcador de afinidad, en el que el marcador de afinidad comprende un primer marcador polipeptídico y un segundo marcador polipeptídico; 5

c) posteriormente a la etapa (b), poner en contacto una pluralidad de células, o una fracción o sobrenadante de las mismas, y la proteína de fusión que comprende el polipéptido vírico fusionado con un marcador de afinidad, en condiciones y durante un periodo suficiente que permita que el resto polipeptídico vírico de la proteína de fusión interaccione con un polipéptido asociado a la pluralidad de células, o fracción o 10 sobrenadante de las mismas, proporcionando un complejo de proteína de fusión: polipéptido celular, en el que el polipéptido vírico exhibe al menos un rasgo de virulencia;

d) aislar el complejo de proteína de fusión: polipéptido celular mediante purificación por afinidad en tándem; y 15

e) determinar la secuencia aminoacídica del polipéptido celular o de al menos un fragmento del polipéptido celular que comprende al menos 8 aminoácidos, e identificar así un polipéptido celular al que se une un polipéptido vírico.

R2. Un método según la R1, en el que el polipéptido vírico comprende al menos 20 aminoácidos. 20

R3. Un método según la R2, en el que el polipéptido vírico comprende al menos 40 aminoácidos.

R4. El método según una cualquiera de las R1 a 3, en el que la etapa (e) comprende (i) escindir el polipéptido celular aislado con una proteasa para generar una pluralidad de fragmentos polipeptídicos del polipéptido celular; (ii) determinar la 25 secuencia aminoacídica de al menos un fragmento polipeptídico, en el que el fragmento comprende al menos 8 aminoácidos; y (iii) comparar la secuencia aminoacídica del al menos un fragmento polipeptídico con la secuencia aminoacídica de un polipéptido celular conocido, identificando así el polipéptido celular al cual se une el polipéptido vírico. 30

R5. El método según la R4, en el que la secuencia aminoacídica se determina mediante un método que comprende cromatografía líquida y espectrometría de masas.

R6. El método según una cualquiera de las R1 a 3, en el que el al menos un rasgo de virulencia se selecciona de (a) el rasgo de que la expresión de un polipéptido vírico mutante en una célula infectada por el virus se correlaciona con una reducción 35 de la virulencia del virus; (b) el rasgo de que la ausencia de expresión del polipéptido vírico en una célula infectada por el virus se correlaciona con una reducción de la virulencia del virus; (c) el rasgo de que la secuencia polinucleotídica en el genoma vírico está localizada en una región genómica que codifica al menos otro polipéptido vírico que es un factor de virulencia vírica; y (d) el rasgo de que el polipéptido vírico 5 que se secreta por una célula infectada por el virus o el polipéptido vírico está asociado a una membrana celular de una célula infectada por el virus.

R7. El método según una cualquiera de las R1 a 3, en el que (a) el virus comprende un genoma de ADN y el virus es un poxvirus, adenovirus, herpesvirus o virus de la hepatitis B; o (b) el virus comprende un genoma de ARN y el virus es un 10 picornavirus, retrovirus, virus de la fiebre hemorrágica o virus de la hepatitis C.

R8. El método según una cualquiera de las R1 a 3, en el que antes de la etapa (d) se somete la pluralidad de células a al menos un estímulo.

R9. El método según la R8, en el que la pluralidad de células es una pluralidad de células inmunitarias y el al menos un estímulo se selecciona de (a) un anticuerpo 15 que se une específicamente a un antígeno asociado expresado por la célula; (b) un éster de forbol; (c) concanavalina A; (d) una citocina; (e) una quimiocina y (f) ionomicina.

R10. El método según una cualquiera de las R1 a 3, en el que la fracción de la pluralidad de células se selecciona de un lisado celular, un extracto celular o al menos 20 un orgánulo celular aislado.

R11. El método según una cualquiera de las R1 a 3, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente un resto detectable.

R12. El método según la R11, en el que el resto detectable se selecciona de un fluoróforo, un radionucleido, una enzima y biotina. 25

R13. El método según una cualquiera de las R1 a 3, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente un tercer marcador polipeptídico.

R14. El método según la R13, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente al menos una secuencia de reconocimiento de proteasa.

R15. El método según la R13, en el que el primer, segundo y tercer 30 marcadores polipeptídicos se seleccionan cada uno independientemente de un péptido de hemaglutinina, un polipéptido de unión a calmodulina, un péptido de unión a estreptavidina, un polipéptido Fc de inmunoglobulina, un polipéptido Fc de muteína de inmunoglobulina, un marcador de proteína C, al menos un dominio de proteína A estafilocócica de unión a inmunoglobulina y un péptido que comprende la secuencia 35 aminoacídica expuesta en la SEC ID Nº 11 (Softag™).

R16. El método según la R15, en el que (a) el primer marcador polipeptídico es un péptido de hemaglutinina, el segundo marcador polipeptídico es un marcador de proteína C y el tercer marcador polipeptídico es un péptido que comprende la secuencia aminoacídica expuesta en la SEC ID Nº 11 (Softag™); o (b) el primer 5 marcador polipeptídico es un péptido de hemaglutinina, el segundo marcador polipeptídico es un marcador de proteína C y el tercer marcador polipeptídico es una proteína de unión a estreptavidina.

R17. El método según la R13, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente un cuarto marcador polipeptídico. 10...

1. Un método de identificación de un polipéptido celular al que se une un polipéptido vírico, que comprende:

a) identificar en el genoma de un virus, usando la bioinformática, una secuencia 5 polinucleotídica que codifica un polipéptido vírico, en el que el polipéptido vírico exhibe al menos un rasgo de virulencia;

b) producir una proteína de fusión que comprende el polipéptido vírico fusionado con un marcador de afinidad, en el que el marcador de afinidad comprende un primer marcador polipeptídico y un segundo marcador polipeptídico; 10

c) posteriormente a la etapa (b), poner en contacto una pluralidad de células, o una fracción o un sobrenadante de las mismas, y la proteína de fusión que comprende el polipéptido vírico fusionado con un marcador de afinidad, en condiciones y durante un periodo suficiente que permita al resto polipeptídico vírico de la proteína de fusión interaccionar con un polipéptido asociado a la pluralidad de células, o fracción o 15 sobrenadante de las mismas, proporcionando una proteína de fusión: complejo polipeptídico celular, en el que el polipéptido vírico exhibe al menos un rasgo de virulencia;

d) aislar el complejo de proteína de fusión: polipéptido celular mediante purificación por afinidad en tándem; y 20

e) determinar la secuencia aminoacídica del polipéptido celular, o de al menos un fragmento del polipéptido celular que comprende al menos 8 aminoácidos, e identificar así un polipéptido celular al que se une un polipéptido vírico.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el polipéptido vírico comprende 25 al menos 20 aminoácidos.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que el polipéptido vírico comprende al menos 40 aminoácidos.

30

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa (e) comprende (i) escindir el polipéptido celular aislado con una proteasa, generando una pluralidad de fragmentos polipeptídicos del polipéptido celular; (ii) determinar la secuencia aminoacídica de al menos un fragmento polipeptídico, en el que el fragmento comprende al menos 8 aminoácidos, y (iii) comparar la secuencia 35 aminoacídica del al menos un fragmento polipeptídico con la secuencia aminoacídica de un polipéptido celular conocido, identificando así el polipéptido celular al que se une el polipéptido vírico.

5. El método según la reivindicación 4, en el que la secuencia aminoacídica se 5 determina mediante un método que comprende cromatografía líquida y espectrometría de masas.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el al menos un rasgo de virulencia se selecciona de (a) el rasgo de que la expresión de un 10 polipéptido vírico mutante en una célula infectada por el virus se correlaciona con una reducción de la virulencia del virus; (b) el rasgo de que la ausencia de expresión del polipéptido vírico en una célula infectada por el virus se correlaciona con una reducción de la virulencia del virus; (c) el rasgo de que la secuencia polinucleotídica en el genoma vírico está localizada en una región genómica que codifica al menos otro 15 polipéptido vírico que es un factor de virulencia vírica; y (d) el rasgo de que el polipéptido vírico se secreta por una célula infectada por el virus o el polipéptido vírico está asociado a una membrana celular de una célula infectada por el virus.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que (a) el 20 virus comprende un genoma de ADN y el virus es un poxvirus, adenovirus, herpesvirus o virus de la hepatitis B; o (b) el virus comprende un genoma de ARN y el virus es un picornavirus, retrovirus, virus de la fiebre hemorrágica o virus de la hepatitis C.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que antes 25 de la etapa (d) se somete la pluralidad de células a al menos un estímulo.

9. El método según la reivindicación 8, en el que la pluralidad de células es una pluralidad de células inmunitarias y el al menos un estímulo se selecciona de (a) un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno asociado expresado por la 30 célula; (b) un éster de forbol; (c) concanavalina A; (d) una citocina; (e) una quimiocina y (f) ionomicina.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fracción de la pluralidad de células se selecciona de un lisado celular, un extracto 35 celular o al menos un orgánulo celular aislado.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente un resto detectable.

5

12. El método según la reivindicación 11, en el que el resto detectable se selecciona de un fluoróforo, un radionucleido, una enzima y biotina.

13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente un tercer marcador polipeptídico. 10

14. El método según la reivindicación 13, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente al menos una secuencia de reconocimiento de proteasa.

15. El método según la reivindicación 13, en el que el primer, segundo y tercer 15 marcadores polipeptídicos se seleccionan cada uno independientemente de un péptido de hemaglutinina, un polipéptido de unión a calmodulina, un péptido de unión a estreptavidina, un polipéptido Fc de inmunoglobulina, un polipéptido Fc de muteína de inmunoglobulina, un marcador de proteína C, al menos un dominio de proteína A estafilocócica de unión a inmunoglobulina y un péptido que comprende la secuencia 20 aminoacídica expuesta en la SEC ID Nº 11 (Softag™).

16. El método según la reivindicación 15, en el que (a) el primer marcador polipeptídico es un péptido de hemaglutinina; el segundo marcador polipeptídico es un marcador de proteína C y el tercer marcador polipeptídico es un péptido que 25 comprende la secuencia aminoacídica expuesta en la SEC ID Nº 11 (Softag™); o (b) el primer marcador polipeptídico es un péptido de hemaglutinina; el segundo marcador polipeptídico es un marcador de proteína C y el tercer marcador polipeptídico es una proteína de unión a estreptavidina.

30

17. El método según la reivindicación 13, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente un cuarto marcador polipeptídico.

18. El método según la reivindicación 17, en el que el cuarto marcador polipeptídico es el mismo que el primer, segundo o tercer marcador polipeptídico. 35

19. El método según la reivindicación 18, en el que el primer marcador polipeptídico es el polipéptido de hemaglutinina; el segundo marcador polipeptídico es el marcador de proteína C; el tercer marcador polipeptídico es el péptido de unión a estreptavidina y el cuarto marcador polipeptídico es una repetición del tercer marcador 5 polipeptídico.

20. El método según la reivindicación 14, en el que el marcador de afinidad comprende adicionalmente una segunda secuencia de reconocimiento de proteasa.

10

21. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína de fusión comprende adicionalmente una secuencia de péptido señal.

22. El método según la reivindicación 21, en el que la secuencia de péptido señal comprende la secuencia aminoacídica MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEC ID 15 Nº 12).

23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente un tipo celular que comprende el polipéptido celular al que se une el polipéptido vírico, comprendiendo dicho método: 20

(i) poner en contacto la proteína de fusión y una muestra biológica que comprende la pluralidad de células, o fracción o sobrenadante de las mismas, en condiciones y durante un periodo suficiente para permitir al resto polipeptídico vírico de la proteína de fusión interaccionar con las células o fracción o sobrenadante de las mismas; 25

(ii) determinar la presencia o ausencia de unión de la proteína de fusión a las células;

(iii) aislar las células a las que se une la proteína de fusión; y

(iv) caracterizar la célula, y a partir de ello determinar el tipo celular que comprende un polipéptido celular al que se une el polipéptido vírico. 30

24. Un método de identificación de un agente para tratar una enfermedad o trastorno inmunitario que comprende:

(a) identificar un polipéptido celular al que se une un polipéptido vírico según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la interacción entre 35 el polipéptido celular y el polipéptido vírico altera la inmunosensibilidad de una célula inmunitaria;

(b) poner en contacto (i) el polipéptido celular, o una célula que comprende el polipéptido celular; (ii) el polipéptido vírico; (iii) y un agente candidato, en condiciones y durante un periodo suficiente que permita interaccionar al polipéptido celular y al 5 polipéptido vírico;

(c) determinar el nivel de unión del polipéptido vírico al polipéptido celular en presencia del agente candidato respecto al nivel de unión del polipéptido vírico al polipéptido celular en ausencia del agente candidato, en el que una reducción del nivel de unión del polipéptido vírico al polipéptido celular en presencia del agente candidato 10 en comparación con el nivel de unión del polipéptido vírico al polipéptido celular en ausencia del agente candidato identifica así un agente para tratar una enfermedad o trastorno inmunitario.

25. El método según la reivindicación 24, en el que el agente se selecciona de (a) 15 un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, (b) una proteína de fusión de polipéptido vírico/polipéptido Fc; (c) una proteína de fusión de péptido/polipéptido Fc; (d) una molécula pequeña; (e) un ARN interferente pequeño (ARNip); (f) un polinucleótido antisentido y (g) un aptámero.