NANOARREGLOS DE PARTÍCULAS BIOLÓGICAS, MÉTODOS PARA LA FABRICACIÓN DE LOS MISMOS.

Un arreglo que comprende: una superficie de sustrato, en donde la superficie del sustrato incluye sitios de enlazamiento para una partícula biológica y también sitios que no enlazan la partícula biológica,

caracterizado porque dichos sitios de enlazamiento incluyen sitios de enlazamiento de iones metálicos, o sitios de enlazamiento para el metal catiónico divalente, en donde los sitios de enlazamiento sobre la superficie de sustrato tienen cada uno una forma y un tamaño; y una partícula biológica dispuesta sobre cada uno de los sitios de enlazamiento, caracterizada porque la partícula biológica es una proteína, un anticuerpo, o una célula

Antecedentes

La tecnología de nanoarreglos ha conducido a significativos avances en muchas áreas de investigación médica y biológica, [1] abriendo avenidas para la selección combinatoria e identificación de polimorfismos de nucleótidos individuales (los SNP), [2] perfilando la expresión de alta sensibilidad de proteínas, [3, 4] y el análisis de alto rendimiento de la función de la proteína. [5] Sin embargo, las tecnologías actuales de microarreglos, tales como formación de puntos con arreglos de clavijas, impresión por inyección de tinta o métodos derivados de fotolitografía, están limitadas en su resolución práctica -desde cientos hasta decenas de micras, dependiendo de la técnica. La densidad de los arreglos fabricados y por lo tanto el número de entidades biológicas distintas depositadas (que incluyen pero no se limitan a proteínas, así nucleico, carbohidratos, lípidos, y especialmente complejos o montajes de los mismos, tales como virus o componentes celulares) están por consiguiente limitadas. Existe por lo tanto la necesidad de un método capaz de formar arreglos a escala de unas pocas micras y por debajo de las micras de dichas entidades biológicas.

Además, las dimensiones de cada sitio en los microarreglos actualmente fabricados son típicamente mucho mayores que el tamaño de las moléculas biológicas individuales o los montajes que están siendo depositados. Por lo tanto, grandes cantidades de dichas entidades están presentes en cada sitio y únicamente se puede estudiar el comportamiento estadístico colectivo de estos conjuntos. Se han depositado partículas biológicas aisladas, por ejemplo, poniendo en contacto una solución muy diluida de dichas partículas biológicas con un sustrato sólido con una química superficial cuidadosamente seleccionada durante un período de tiempo cuidadosamente seleccionado, seguido opcionalmente por etapas de lavado. Éste método ofrece poco o ningún control sobre la densidad y la ubicación de dichas partículas. Existe por lo tanto la necesidad de un método de miniaturización -por debajo de la escala de longitud de los nanómetros -con el potencial para el "aislamiento en el sitio" de entidades biológicas a escala micro y nano a nivel de partículas individuales con un posicionamiento preciso. Con tal método, estarán disponibles nuevas oportunidades para las comunidades que hacen investigaciones en el campo bioquímico y biomédico para empezar a estudiar tales entidades en forma individual en vez de colectivamente. El aislamiento en el sitio es de interés comercial, por ejemplo en R&D farmacéutico durante el descubrimiento de fármacos especialmente para elucidar rápidamente el mecanismo fundamental de interacción entre un candidato a fármaco y su objetivo -sin necesidad de utilizar técnicas difíciles y que consumen mucho tiempo como la cristalización y los análisis de rayos X. Otros experimentos biológicos comercialmente relevantes de partículas individuales incluyen, por ejemplo, el estudio de (a) el efecto de la orientación relativa entre entidades biológicas sobre sus interacciones;

(b) el comportamiento cooperativo de un número seleccionado de patógenos que infectan simultáneamente por ejemplo una célula; (c) el enlazamiento de un anticuerpo individual con un antígeno o a la inversa, el comportamiento cooperativo de anticuerpos múltiples hacia un antígeno; (d) variaciones en la interacción de un fármaco objetivo con formas individuales de una proteína polimórfica o aquella de diferentes miembros de la misma familia de proteínas; y (e) el efecto de variaciones genéticas en relación con su interacción con otro producto biológico.

Antes de esta invención, se habían hecho avances en la inmovilización de partículas virales sobre plantillas creadas por medio de DPN e impresión por microcontacto. [11, 12] Sin embargo, existe la necesidad de permitir la posibilidad de controlar químicamente la posición de las estructuras de virus inmovilizados a nivel de partículas individuales. Esto es en parte debido a una resolución limitada (véase más arriba), al tamaño de las partículas interrogadas, y especialmente a la química utilizada para inmovilizarlas. De hecho, los esfuerzos previos se han enfocado sobre la modificación genética de una partícula viral para que presente una funcionalidad de enlazamiento superficial no natural con la interfaz modelada. [11, 12] Por razones de costo y de escalabilidad, es preferible evitar la manipulación de tales virus. Existe por lo tanto la necesidad por un método para controlar químicamente la posición de las estructuras de los virus inmovilizados a nivel de partículas individuales sin la necesidad de modificar química

o genéticamente dichos virus.

Vega et al. "Nanoarrays of single virus particles", Angewandte Chemie. International Edition, VCH Verlag, Weinheim, DE, vol. 44, no.37, 22 de agosto de 2005, páginas 6013 -6015, describe una aproximación para la inmovilización de partículas del virus TMV sobre superficies. A través del uso de DPN y de rasgos pequeños, se pueden aislar partículas virales y se puede controlar la orientación de las mismas.

US 2003/0068446 A1 describe el uso de DPN para construir nanoarreglos de péptido y de proteína de alta densidad. El método puede ser llevado a cabo con una variedad de estructuras de péptido y de proteína, incluyendo enzimas y anticuerpos.

Rozhok et al. "Methods for Fabricating Microarrays of Motile Bacteria", small, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA, Weinheim, DE, Abril de 2005, páginas 445 -451 describe la fabricación de microarreglos de células individuales en donde las células individuales están unidas a una línea prediseñada o rasgos puntuales. No se reconoce que alguna de las referencias citadas en esta sección de Antecedentes o a partir de entonces haga parte del estado del arte.

Resumen de la invención

La invención se relaciona en general con arreglos de entidades biológicas y en particular con arreglos de entidades biológicas aisladas en el sitio. Se relaciona además con (a) el uso de impresión nanolitográfica de escritura directa para la fabricación de los mismos; y (b) métodos para el uso de estos arreglos.

La presente invención proporciona en algunas modalidades arreglos de partículas biológicas, en las cuales al menos una de las dimensiones laterales de los sitios está en el rango de unas pocas micras o por debajo del rango de las micras (incluidos los nanoarreglos). La invención también divulga arreglos diseñados organizados de partículas biológicas aisladas en el sitio y especialmente arreglos de partículas virales aisladas en el sitio.

La invención divulga arreglos y métodos para la fabricación de dichos arreglos.

Se describe un enfoque químico con base en iones metálicos de coordinación versátil, para la inmovilización de partículas virales del TMV sobre superficies y se demuestra que a través del uso de DNP y de rasgos pequeños, es posible aislar y controlar la orientación de estas partículas virales. Muchas partículas virales tienen Zn2+ y otros grupos para enlazamiento de metales en sus recubrimientos de proteína. [18] Por lo tanto, se pueden generalizar este enfoque para manipular muchas clases de estructuras virales a nivel de partículas individuales. Tales posibilidades expandirán el alcance de la solicitud para estructuras virales en campos que van desde la biología hasta la electrónica molecular, [19] donde tal control abre nuevas oportunidades para la investigación que no puede ser abordada con microarreglos o sistemas a granel.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Diagrama esquemático que describe la inmovilización selectiva de partículas virales individuales sobre nanoplantillas de MHA generadas por DPN con una solución de Zn(NO3)2·6H2O. El diagrama no está a escala.

Figura 2. Diagrama esquemático que describe (a) la superficie externa del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV), que presenta un alto número de grupos carboxílicos/carboxilato de los aminoácidos glutamato y aspartato. Se desprotona el TMV a pH 3,5; (b) el sándwich formado por los grupos carboxilato del patrón monocapa autoensamblado del ácido mercaptohexadecanoico, por un lado, los cationes Zinc y los grupos carboxilato presentes sobre el virus TMV, por el otro. Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que el puente electrostático formado por los iones zinc cargados positivamente y los carboxilatos cargados negativamente es responsable por la inmovilización de dicho virus TMV... [Seguir leyendo]

1. Un arreglo que comprende: una superficie de sustrato, en donde la superficie del sustrato incluye sitios de enlazamiento para una partícula biológica y también sitios que no enlazan la partícula biológica, caracterizado porque dichos sitios de enlazamiento incluyen sitios de enlazamiento de iones metálicos, o sitios de enlazamiento para el metal catiónico divalente, en donde los sitios de enlazamiento sobre la superficie de sustrato tienen cada uno una forma y un tamaño; y una partícula biológica dispuesta sobre cada uno de los sitios de enlazamiento, caracterizada porque la partícula biológica es una proteína, un anticuerpo, o una célula.

2. El arreglo de acuerdo a la reivindicación 1, en donde la partícula biológica asume una orientación específica.

3. Un método para elaborar un arreglo que comprende la combinación de etapas: proveer una superficie de un sustrato, modificar la superficie del sustrato para proveer sitios de enlazamiento para la partícula biológica y también sitios que no enlazan ninguna partícula biológica, en donde dichos sitios de enlazamiento incluyen sitios de enlazamiento de iones metálicos, o sitios de enlazamiento de metales catiónicos divalentes, enlazándose la partícula biológica a los sitios de enlazamiento para la partícula biológica de tal manera que sustancialmente únicamente una partícula biológica se enlaza a cada sitio, caracterizado porque la partícula biológica es una proteína, un anticuerpo,

o una célula.

4. El método de acuerdo a la reivindicación 3, en donde los sitios de enlazamiento para la partícula biológica tienen una dimensión lateral entre 5 µmy1 µm, o entre 1 µm y 500 nm, o entre 500 nm y 300 nm, o entre 300 nm y 100 nm, o inferior a 100 nm, preferiblemente menor a 50 nm, o aproximadamente menor a un µm, o proporcionan un área superficial aproximadamente menor a 100.000 nm cuadrados para cada sitio.

5. El método de acuerdo a la reivindicación 4, en donde los sitios de enlazamiento para la partícula biológica tiene la forma de un círculo, un cuadrado, o un rectángulo, o en donde los sitios de enlazamiento tiene una forma lineal o una curvilínea.

6. El método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde los sitios rectangulares están entre 600 nm x 200 nm y 500 nm x180 nm, o entre 500 nm x 180 nm y 400 nm x150 nm,o entre 400 nm x150 nm y 350 nm x110 nm enlongitud y ancho.

7. El método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde los sitios con forma de punto están entre 1000 nm y 500 nm de diámetro, preferiblemente entre 500 nm y 350 nm o entre 350 nm y 100 nm de diámetro, más preferiblemente menor a 100 nm de diámetro.