PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-HISTIDINA UTILIZANDO BACTERIAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIÁCEAS.

Procedimiento para producir L-histidina utilizando bacterias de la familia Enterobacteriáceas. Campo técnico La presente invención se refiere a la biotecnología, y especialmente a un procedimiento para producir, mediante fermentación, un L-amino ácido tal como la L-histidina. La presente invención se refiere además a un gen derivado de una bacteria Escherichia coli. El gen resulta útil para mejorar la producción de L-histidina. Antecedentes de la técnica Convencionalmente, los L-aminoácidos se han obtenido industrialmente mediante fermentación, utilizando cepas de microorganismos obtenidos a partir de fuentes naturales, o mutantes de los mismos, modificados para aumentar la productividad de los L-aminoácidos. Se ha informado de muchas técnicas con respecto al aumento de la producción de los L-aminoácidos, por ejemplo, mediante la transformación del microorganismo mediante ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente US nº 4.278.765). Estas técnicas están basadas en el aumento de las actividades de las enzimas implicadas en la biosíntesis de los aminoácidos y/o en las enzimas de desensibilización de las dianas a partir de la inhibición retroactiva por el L-aminoácido producido (véase, por ejemplo, la solicitud japonesa abierta al público nº 56-18596 (1981), WO 95/16042 o las patentes US nº 5.661.012 y nº 6.040.160). El gen talB codifica la transaldolasa (TAL, D-sedoheptulosa-7-fosfato: D-gliceraldehído-3-fosfatodihidroxiacetonatransferasa) [EC 2.2.1.2], una enzima del ciclo no oxidativo de las pentosas fosfato (Sprenger G.A. et al, J. Bacteriol., 1995, Oct 177:20, 5930-6). La transaldolasa constituye una enzima clave en la biosíntesis de la ribosa-5-fosfato a partir de los productos de la glicólisis. La enzima cataliza la transferencia reversible de una fracción dihidroacetónica derivada de la fructosa-6-fosfatasa a la eritrosa-4-fosfato, formando seduheptulosa-7fosfato y liberando gliceraldehído-3-fosfato. Entonces, la seduheptulosa-7-fosfato y el gliceraldehído-3-fosfato se convierten en dos moléculas de pentosa-5-fosfato mediante la actividad de la transcetolasa. Anteriormente, se ha informado de que el aumento de la actividad de la transaldolasa es útil para la producción microbiana de sustancias a partir del metabolismo aromático, en particular los aminoácidos aromáticos tales como la L-fenilalanina (patente US nº 6.316.232). Recientemente, se ha sugerido, basándose únicamente en la teoría, que puede llevarse a cabo la preparación de L-treonina mediante la fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas con lo cual uno o más genes de un amplio grupo de genes, que incluyen el gen talB, se atenúan, y en particular, se eliminan (WO03008600A2). Al mismo tiempo, y en abierta contradicción con esto, se dio a conocer en WO03/008611A2 la preparación de L-treonina mediante fermentación de microorganismos de la familia de las Enterobacteriáceas, en la cual se aumenta, y se sobreexpresa en particular, la expresión de, por lo menos, el gen talB. En Lu J-L et al: "Metabolic engineering and control analysis for production of aromatics: Role of transaldolase", Biotechnology and Bioengineering, vol. 53, nº 2, 1997, páginas 132-138, se da a conocer la utilización de una bacteria que sobreexpresa talB para la producción de aminoácidos aromáticos. Sin embargo, hasta la fecha, no han existido informes que describan la amplificación del gen talB con el propósito de aumentar la producción de L-histidina utilizando cepas de la familia Enterobacteriáceas. Exposición de la invención Un objetivo de la presente invención consiste en desarrollar una cepa del microorganismo productor de L-histidina, que muestre un aumento de la producción de L-histidina. Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir L-histidina, utilizando dicha cepa. La presente invención proporciona lo siguiente: ES 2 367 782 T3 (1) Una bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria se ha modificado, de forma que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada, aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa, o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y (B) la proteína de (A) que incluye deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en 2 la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que posee actividad enzimática transaldolásica, en la que dicha bacteria muestra un aumento de la expresión de por lo menos un gen, seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA, hisF y hisI. (2) Una bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria se ha modificado, de forma que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada, aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa, o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en la que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y (B) la proteína de (A) que incluye deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que posee actividad enzimática transaldolásica; en la que dicha bacteria muestra un aumento de la expresión de un gen de la ATP fosforibosiltransferasa de Escherichia coli. (3) La bacteria según (2), en la que dicho gen de la ATP fosforibosiltransferasa es desensibilizado a la inhibición retroactiva por la L-histidina. (4) Un procedimiento para producir L-histidina, que comprende el cultivo de una bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas en un medio de cultivo, y la recuperación a partir del medio de cultivo de la Lhistidina acumulada, en el que la bacteria se ha modificado, de modo que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada, aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa, o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en el que dicho gen de la transaldolasa codifique una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y (B) la proteína de (A) que incluye deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que posee actividad enzimática transaldolásica. (5) El procedimiento según (4), en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína que posee una identidad del 95% o más con la secuencia aminoácida de SEC. ID. nº:2, y posee actividad enzimática transaldolásica. (6) El procedimiento según (4), en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2. (7) El procedimiento según (4), en el que dicho gen de la transaldolasa comprende una secuencia nucleotídica de los nucleótidos 1 a 954 en SEC ID nº:1. (8) El procedimiento según cualquiera de (4) a (7), en el que dicha bacteria pertenece al género Escherichia. (9) El procedimiento según (8), en el que dicha bacteria es la Escherichia coli. (10) El procedimiento según cualquiera de (4) a (9), en el que el número de copias del gen de la transaldolasa aumenta mediante la transformación de dicha bacteria con un vector multicopia que alberga dicho gen de la transaldolasa. (11) El procedimiento según cualquiera de (4) a (10), en el que dicha bacteria posee una expresión aumentada de por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA, hisF y hisI. (12) El procedimiento según cualquiera de (4) a (10), en el que dicha bacteria posee una expresión aumentada de un gen de la ATP fosforibosiltransferasa de la Escherichia coli. (13) El procedimiento según (12), en el que dicho gen de la ATP fosforibosiltransferasa es desensibilizado a la inhibición retroactiva mediante la L-histidina. Formas de realización preferidas de la invención ES 2 367 782 T3 Los objetivos mencionados anteriormente se alcanzaron identificando el gen talB que codifica la transaldolasa (TAL, 3 ES 2 367 782 T3 D-sedoheptulosa-7-fosfato:D-gliceraldehído-3-fosfato-dihidroxiacetonatransferasa) [EC 2.2.1.2], que no está implicada en la vía biosintética del L-aminoácido diana, pero que puede aumentar la producción... [Seguir leyendo]

1. Bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en la que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y (B) la proteína de (A) que comprende deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que presenta una actividad enzimática transaldolásica, en la que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA, hisF y hisI. 2. Bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en la que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y (B) la proteína de (A) que comprende deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que presenta actividad enzimática transaldolásica, en la que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de un gen de la ATP fosforibosiltransferasa de la Escherichia coli. 3. Bacteria según la reivindicación 2, en la que dicho gen de la ATP fosforibosiltransferasa es desensibilizado a la retroinhibición por la L-histidina. 4. Procedimiento para producir L-histidina, que comprende el cultivo de una bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas en un medio de cultivo, y la recogida a partir del medio de cultivo de la L-histidina acumulada, en el que la bacteria se ha modificado de manera que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y (B) la proteína de (A) que comprende deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que presenta actividad enzimática transaldolásica. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína que presenta una identidad de 95% o más con la secuencia aminoácida de SEC. ID. nº:2, y presenta una actividad enzimática transaldolásica. 6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2. 7. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho gen de la transaldolasa comprende una secuencia nucleotídica de los nucleótidos 1 a 954 en SEC ID nº:1. 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que dicha bacteria pertenece al género Escherichia. 9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha bacteria es la Escherichia coli. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el número de copias del gen de la transaldolasa es aumentado mediante la transformación de dicha bacteria con un vector multicopia que contiene dicho gen de la transaldolasa. 11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en el que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA, 12 hisF y hisI. ES 2 367 782 T3 12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en el que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de un gen de la ATP fosforibosiltransferasa de la Escherichia coli. 13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho gen de la ATP fosforibosiltransferasa es desensibilizado a la retroinhibición por la L-histidina. 13