PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR METABOLITOS SINTETIZADOS BIOLÓGICAMENTE MEDIANTE PIROFOSFATO DE FOSFORRIBOSILO.

Se proporciona un procedimiento industrial más ventajoso para la producción de metabolitos sintetizados biológicamente vía fosforibosil pirofosfato (PRPP),

haciendo uso de cepas modificadas metabólicamente en las cuales la actividad transcetolasa es deficiente o reducida si se compara con la cepa madre

Procedimiento para producir metabolitos sintetizados biológicamente mediante pirofosfato de fosforribosilo.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de sustancias útiles que se sintetizan por un procedimiento de fermentación en la serie de reacciones de biosíntesis a partir de pirofosfato de fosforribosilo (denominado "PRPP" en adelante) utilizando una cepa modificada en el metabolismo, que es completamente carente de actividad de transcetolasa o que presenta actividad de transcetolasa reducida en comparación con la cepa original.

Los ejemplos de sustancias útiles sintetizadas a partir de PRPP en la serie de reacciones metabólicas microbianas incluyen sustancias relacionadas con ácidos nucleicos tales como nucleótidos púricos, nucleótidos pirimidínicos, nucleósidos púricos, nucleósidos pirimidínicos, bases púricas, bases pirimidínicas y nucleótidos de flavina, así como L-histidina y riboflavina.

Estas sustancias relacionadas con los ácidos nucleicos, L-histidina, riboflavina y similares se han producido industrialmente por un procedimiento de fermentación o por una combinación de un procedimiento de fermentación con un procedimiento de síntesis. Véase Applied Microbiology, editado por Soichi Takao et al., Buneido Shuppan (1996); Amino Acid Fermentation, editado por Hiroshi Aida et al., Gakkai Shuppan Center (1986); documento JP-A-6-225776 ("JP-A" tal como se utiliza en la presente memoria significa una solicitud de patente japonesa publicada sin examinar'').

En los microorganismos, PRPP es sintetizado biológicamente por una PRPP sintetasa a partir de ribosa 5-fosfato que es un compuesto intermedio en la serie de reacciones de pentosa fosfato.

En cuanto a las series de reacciones de biosíntesis de ribosa 5-fosfato, se conoce una serie de reacción oxidativa de pentosa fosfato a través de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, y es de esperar que una serie de reacciones de pentosa fosfato no oxidativa esté también implicada en su biosíntesis porque todas las enzimas en la serie de reacciones no oxidativa de pentosa fosfato a través de la reacción de transcetolasa son reversibles (véase la figura 1).

Se ha determinado mediante un estudio del metabolismo de la glucosa marcada que ambas de estas series de reacciones se refieren a la biosíntesis de ribosa 5-fosfato Escherichia coli, véase Biochemistry, 12, 10, 1969 (1973). Además, se ha demostrado mediante estudios genéticos, que la ribosa 5-fosfato es suministrada por la serie de reacciones de pentosa fosfato no oxidativa a través de la reacción de transcetolasa, porque las cepas carentes de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa de Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum no presentan auxotrofía de la ribosa, véase D.G. Fraenkel y R.T Vinopal, Ann. Rev. Microbiol., 27, 69-100 (1973); E.D. Ihnen y A L. Demain, J. Bacteriol., 98, 1151-1158 (1969).

Esta información sugiere que el aumento en la actividad de la transcetolasa permite un aumento del aporte de ribosa 5-fosfato y de PRPP procedente de la serie de reacciones no oxidativa y por consiguiente aumenta la cantidad de sustancias biológicamente sintetizadas a partir de PRPP.

Además, se ha publicado que una cepa carente de actividad de transcetolasa en las cepas que producen inosina que pertenecen al género Bacillus tal como Bacillus subtilis acumula una cantidad considerable de ribosa en el medio de cultivo de modo que el rendimiento de la producción de nucleótidos púricos se reduce, véase K. Sasajima y M. Yoneda, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 2, 175-213 (1984).

Esta información sugiere también que la actividad de la transcetolasa es necesaria para la producción de sustancias biológicamente sintetizadas a partir de PRPP. Sin embargo, hasta la fecha, con respecto a todos los microorganismos, no se ha sabido que el rendimiento de la producción de metabolitos que han de sintetizarse biológicamente a partir de PRPP mejore por pérdida o reducción de la actividad de la transcetolasa.

Dado que la demanda de metabolitos sintetizados biológicamente ha aumentado a partir de PRPP, las sustancias relacionadas con el ácido nucleico específicamente, L-histidina, riboflavina y similares, es muy deseable el desarrollo de un procedimiento industrialmente ventajoso para su producción.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento industrialmente ventajoso para la producción de metabolitos sintetizados biológicamente a partir de PRPP.

En los estudios convencionales sobre el cultivo de microorganismos, se han alcanzado grandes logros por la mejora del metabolismo de la serie de reacciones de biosíntesis terminal afectadas en la biosíntesis de cada metabolito de interés.

En la presente invención se ha considerado que otra modificación aparte de la mejora metabólica de la serie de reacciones de biosíntesis terminal, es decir de la modificación del metabolismo central capaz de modificar el aporte y la mezcla del sustrato de partida, sería necesaria para mejorar más la productividad de los metabolitos y realizar estudios exhaustivos sobre la influencia del flujo del carbono en varios metabolitos manipulando la serie de reacciones metabólica central en los microorganismos.

Como resultado, se ha observado que la eficacia de la producción de metabolitos biológicamente sintetizados a partir de PRPP en la serie de reacciones de biosíntesis puede mejorarse haciendo que la actividad de la transcetolasa sea insuficiente o reducida en comparación con la de una cepa original de la misma, dando como resultado de este modo la realización de la presente invención.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar:

La figura 1 es un gráfico que presenta la serie de reacciones metabólica desde glucosa hasta PRPP. En la figura 1, las flechas grises muestran las reacciones mediante transcetolasa.

A continuación se describe con detalle la presente invención.

La frase "microorganismo en el que la actividad de transcetolasa es reducida en comparación con una cepa original de la misma" tal como se utiliza en la presente memoria incluye todas las cepas que presentan cualquier grado de actividad de transcetolasa reducida en comparación con una cepa original determinada en las condiciones descritas en los ejemplos a continuación. La reducción en la actividad de transcetolasa es del 30% o más, preferentemente 50% o más. Los ejemplos de cepas en las que la actividad de transcetolasa es insuficiente o reducida incluyen las cepas con una o más modificaciones de nucleótidos que producen carencia o reducción en la actividad de transcetolasa, modificaciones que se seleccionan de entre sustituciones, eliminaciones, inserciones, adiciones e inversiones de nucleótidos en la secuencia nucleotídica del gen estructural de transcetolasa o del gen que participa en la transcripción o traducción del gen estructural de transcetolasa.

El microorganismo que debe utilizarse...

1. Procedimiento para la producción aumentada de metabolitos biológicamente sintetizados mediante pirofosfato de fosforribosilo en la serie de reacciones metabólicas en un microorganismo, comparada con la de una cepa original del mismo, que comprende

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el metabolito es un nucleótido púrico, nucleótido pirimidínico, nucleósido púrico, nucleósido pirimidínico, base púrica, base pirimidínica, nucleótido de flavina, L-histidina y riboflavina.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho microorganismo es TKT6 de Corynebacterium glutamicum, TKT6/pPH8 de Corynebacterium glutamicum, TKT6/pFM41 de Corynebacterium glutamicum o AI80/pFM201 de Escherichia coli.

4. Microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium, en el que la actividad de transcetolasa es insuficiente o reducida en comparación con una cepa original del mismo, en el que dicho microorganismo es TKT6 de Corynebacterium glutamicum, TKT6/pPH8 de Corynebacterium glutamicum o TKT6/pFM41 de Corynebacterium glutamicum.