Un procedimiento para producir al menos un metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido L-glutámico,

L-glutamina, L-prolina, y L-leucina que comprende cultivar una bacteria que tiene de forma inherente actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa en un medio de cultivo, y recoger dicho metabolito útil del medio de cultivo y/o la bacteria, en el que dicha bacteria tiene una capacidad de producir dicho metabolito útil, y en el que la bacteria está modificada para aumentar la actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6fosfato fosfocetolasa aumentando la cantidad de copias del gen respectivo, o sustituyendo o modificando el promotor

El uso de fosfocetolasa para producir metabolitos útiles.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina y L-leucina. La presente invención también se refiere a nuevas bacterias útiles en el procedimiento de producción.

Convencionalmente, los metabolitos útiles tales como L-aminoácidos, sus intermedios, y otros compuestos químicos del metabolismo bacteriano se producen por procedimientos en los que se han modificado cepas bacterianas aisladas de fuentes naturales, o mutantes de las mismas, para potenciar su productividad.

El azúcar es la fuente principal de carbono en un microorganismo que es adecuado para fermentación. Las rutas de Embden-Meyerhof y de la pentosa fosfato (pentosa-P) son las dos rutas preliminares del metabolismo intermediario del azúcar en un microorganismo. Una tercera ruta, la ruta de Entaer-Doudoroff, también es conocida, ya que tiene algunas conexiones con las rutas de ácido carboxílico. Durante la glucolisis, la glucosa se metaboliza en compuestos intermedios principales, tales como fosfoenolpiruvato, piruvato, y acetil-coenzima A, que se usan como constituyentes en la formación de muchos compuestos celulares, tales como L-aminoácidos, purinas y pirimidinas, vitaminas, etc. Además, la generación de energía (ATP y NADH) sucede durante la glucolisis. El piruvato formado después de la glucolisis a menudo se convierte de nuevo en fosfoenolpiruvato (PEP) por la fosfoenolpiruvato sintasa codificada por el gen pps, o en acetil-CoA por la piruvato deshidrogenasa codificada por el gen pdh etc. Uno de los compuestos mencionados anteriormente, la acetil-CoA, se forma a partir del piruvato mediante la piruvato deshidrogenasa, y acompañada por la liberación de CO₂. Esta pérdida de un átomo de carbono provoca rendimientos de producción disminuidos de los compuestos útiles derivados de la acetil-CoA.

Se ha informado de dos enzimas de la ruta bifidum, la D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa (también conocida como "fosfocetolasa") y la fructosa-6-fosfato fosfocetolasa. La D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa (EC 4.1.2.9) cataliza la conversión con consumo de fosfato de la xilulosa-5-fosfato en gliceraldehído-3-fosfato y acetilfosfato, con la liberación concomitante de una molécula de agua. La fructosa-6-fosfato fosfocetolasa (EC 4.1.2.22) cataliza la conversión con consumo de fosfato de fructosa-6-fosfato en eritrosa-4-fosfato y acetilfosfato, con la liberación concomitante de una molécula de agua. Ambas enzimas forman acetilfosfato, el precursor de la acetil-CoA, sin perder carbono mediante CO₂. Se ha informado de la D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa (EC 4.1.2.9) en bacterias que pertenecen a los géneros Acetobacter (Schramm, M. y col., J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)), Bifidobacterium (Sgorbati, B. y col., Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57 (1976); Grill, J.P. y col. Curr Microbiol., 31(1), 49-54 (1995)) Lactobacillus (Posthuma, C.C. y col., Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)), Thiobacillus (Greenley, D.E. y Smith, D.W., Arch. Microbiol., 122, 257-261 (1979)), en levaduras que pertenecen a los géneros Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Pichia, Yarrowia, Hansenula, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Trichosporon, Wingea (Evans, C.T. y Ratledge, C., Arch. Microbiol., 139, 48-52 (1984); Ratledge, C. y Holdsworth, J.E., Appl. Microbiol. Biotechnol., 22, 217-221 (1985)). Se ha informado de la fructosa-6-fosfato fosfocetolasa (EC 4.1.2.22) en bacterias, tales como Acetobacter xylinum (Schramm, M. y col., J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)), Bifidobacterium globosum y Bifidobacterium dentium (Sgorbath, B. y col., Antonie Leeuwenhoek, 42, 49-57 (1976)), Bifidobacterium bifidum, Gardnerella vaginalis (Gavini, F. y col., Anaerobe, 2, 191-193 (1996)), y levaduras, tales como Rhodotorula graminis, Rhodotorula glutinis, Candida sp., Candida tropicalis, Saccharomyces pastorianus (Whitworth, D.A. y Ratledge, C., J. Gen. Microbiol., 102, 397-401 (1977)). Se ha informado de que en algunos organismos ambas actividades están representadas por una enzima (véase, por ejemplo, los artículos de Schramm, M. y col. (J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)); Sgorbati, B. y col. (Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57 (1976)); Meile, L. y col. (J. Bacteriol., 183(9), 2929-36 (2001))).

Se han clonado los genes de la fosfocetolasa de dos especies y se han determinado sus secuencias. Éstos son el gen xfp que codifica la D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa/fructosa-6-fosfato fosfocetolasa de Bifidobacterium lactis (Meile, L. y col., J. Bacteriol., 183(9), 2929-36 (2001)), y el gen xpkA que codifica la D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa de Lactobacillus pentosus (Posthuma, C.C. y col., Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)). Una búsqueda de la bases de datos Microbial Genome proporcionada por el National Center for Biotechnology information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=&DB=genome) reveló varios genes que codifican fosfocetolasas putativas.

Se conocen procedimientos para mejorar la capacidad de las levaduras para producir etanol a partir de xilosa introduciendo genes para la xilosa reductasa, la xilitol deshidrogenasa y adicionalmente la fosfocetolasa (documento WO2003078643). Sin embargo, nunca se ha informado de los efectos de usar el gen de la fosfocetolasa para la eliminación de dióxido de carbono.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es potenciar la producción de metabolitos útiles por cepas de bacterias que tienen la capacidad de producir los metabolitos así como proporcionar un procedimiento para producir los metabolitos usando estas cepas.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una bacteria que tenga la capacidad de producir un metabolito útil, estando la bacteria modificada para que tenga una actividad aumentada de la D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o la fructosa-6-fosfato fosfocetolasa.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el metabolito útil se obtiene de la acetil-coenzima A.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el metabolito útil se selecciona entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, L-cisteína, succinato, y polihidroxibutirato.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una bacteria que tenga una capacidad de producir un metabolito útil, no teniendo la bacteria de forma inherente una actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa, y habiéndose transformado dicha bacteria con un fragmento de ADN que codifica la D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o la fructosa-6-fosfato fosfocetolasa.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el metabolito útil se obtiene de la acetil-coenzima A.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el metabolito útil se selecciona entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, L-cisteína, succinato, y polihidroxibutirato.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, seleccionándose la bacteria entre el grupo constituido por la familia Enterobacteriaceae, la bacteria Coryneform, y la bacteria Bacillus.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, perteneciendo la bacteria al género Escherichia o Pantoea.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir un metabolito útil, que comprende cultivar la bacteria en un medio de cultivo, y recoger el metabolito útil del medio de cultivo.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que el metabolito útil se obtiene de la acetil-coenzima A.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que el metabolito útil se selecciona entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina,...

1. Un procedimiento para producir al menos un metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, y L-leucina que comprende cultivar una bacteria que tiene de forma inherente actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa en un medio de cultivo, y recoger dicho metabolito útil del medio de cultivo y/o la bacteria,

en el que dicha bacteria tiene una capacidad de producir dicho metabolito útil, y

en el que la bacteria está modificada para aumentar la actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa aumentando la cantidad de copias del gen respectivo, o sustituyendo o modificando el promotor.

2. Un procedimiento para producir al menos un metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, y L-leucina que comprende cultivar una bacteria que no tiene de forma inherente actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato fosfocetolasa en un medio de cultivo, y recoger dicho metabolito útil del medio de cultivo y/o la bacteria,

en el que dicha bacteria tiene una capacidad de producir dicho metabolito útil, y

en el que dicha bacteria está transformada con un fragmento de ADN que codifica la D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o la fructosa-6-fosfato fosfocetolasa.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la bacteria tiene un gen mutado o alterado que codifica la 6-fosfofructoquinasa con actividad 6-fosfofructoquinasa reducida.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la bacteria se selecciona entre el grupo constituido por Enterobacteriaceae, bacterias Coryneform, y bacterias Bacillus.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la bacteria pertenece al género Escherichia o Pantoea.

6. Una bacteria que tiene una capacidad de producir al menos un metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, y L-leucina,

estando la bacteria modificada para tener una actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa aumentada aumentando la cantidad de copias del gen respectivo, o sustituyendo o modificando el promotor y tiene un gen mutado o alterado que codifica la 6-fosfofructoquinasa que tiene una actividad 6-fosfofructoquinasa reducida.

7. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 6, seleccionándose la bacteria entre el grupo constituido por Enterobacteriaceae, bacterias Coryneform, y bacterias Bacillus.

8. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 6, perteneciendo la bacteria al género Escherichia o Pantoea.

9. Una bacteria que tiene de forma inherente actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa, teniendo dicha bacteria una capacidad de producir un metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, y L-leucina, y estando dicha bacteria modificada para aumentar la actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa aumentando la cantidad de copias del gen respectivo o sustituyendo o modificando el promotor.

10. Una bacteria que no tiene de forma inherente actividades D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato fosfocetolasa, estando dicha bacteria transformada con un fragmento de ADN que codifica la D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa, y teniendo dicha bacteria una capacidad de producir y causar la acumulación en un medio de una cantidad no menor de 0,5 g/l de al menos un metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, y L-leucina.