PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION A BASE DE 4-HIDROXIPROLINA Y SUS UTILIZACIONES EN EL CAMPO AGRONOMICO.
Procedimiento para el aislamiento de polipéptidos ricos en 4-hidroxiprolina,
que caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) fermentación de un cultivo de células de tabaco;
b) separación de las células de tabaco del medio de fermentación;
c) homogenización de las células de tabaco;
d) hervido de las paredes celulares con el fin de eliminar las pectinas y los almidones;
e) tratamiento de las paredes celulares con una disolución de ácido con el fin de separar los azúcares unidos a las proteínas de las paredes;
f) digestión de las proteínas de las paredes mediante hidrólisis enzimática con pepsina
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/002075.
Solicitante: ARTERRA BIOSCIENCE S.R.L.
Nacionalidad solicitante: Italia.
Dirección: VIA BENEDETTO BRIN, 69,80142 NAPOLI.
Inventor/es: CHRISPEELS, MAARTEN, J., COLUCCI,MARIA,GABRIELLA, APONE,FABIO.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 11 de Noviembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01N43/36 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES. › A01N 43/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos heterocíclicos (que contienen anhídridos cíclicos, imidas cíclicas A01N 37/00; que contienen compuestos de fórmula , que no tienen más que un heterociclo en los que m≥1 y n≥0 y es una pirrolidina, una piperidina, una morfolina, una tiomorfolina, una piperazina o una polimetilenoimina, no sustituida o sustituida por un alcoilo, que tiene al menos cuatro grupos CH 2 A01N 33/00 - A01N 41/12; que contienen ácidos ciclopropanocarbhoxílicos o sus derivados, p. ej. ésteres con heterociclos, A01N 53/00). › ciclos de cinco elementos.
- C12P13/24 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Prolina; Hidroxiprolina; Histidina.
- C12P21/06 C12P […] › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.
Clasificación PCT:
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para la preparación de una composición a base de 4-hidroxiprolina y sus utilizaciones en el campo agronómico.
La presente invención se refiere a un procedimiento destinado a la preparación de polipéptidos ricos en 4-hidroxiprolina y a sus utilizaciones en el campo agronómico.
En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de polipéptidos ricos en 4-hidroxi-L-prolina y composiciones con un elevado contenido en estos polipéptidos y la utilización de la misma como producto agroquímico en el campo de la agronomía y como producto intermedio en la síntesis de compuestos químicos.
La 4-hidroxiprolina, un derivado hidroxilado (4-HO-Pro) de la prolina, es un aminoácido de considerable importancia biológica típicamente encontrado en el colágeno.
La hidroxiprolina se obtiene en la actualidad a partir de fuentes proteicas de origen animal, del cerdo o de bovino.
Los procedimientos para obtener oligopéptidos ricos en hidroxiprolina contemplan que la fuente de proteína de origen animal se muela primero y se preserven en ambientes a baja temperatura hasta el momento del tratamiento, que comprende las siguientes etapas:
Sin embargo, el procedimiento utilizado en la actualidad presenta múltiples desventajas tales como la obtención de una concentración total de hidroxiprolina libre o en péptido inferior a entre el 12 y el 14% con respecto a la masa de aminoácidos presente, además del riesgo de contaminación por péptidos bioactivos peligrosos. Esto se puede asociar con el riesgo a la contaminación por una proteína modificada (con respecto a la forma no-patológica
) denominada prión
responsable del desarrollo de algunas patologías graves entre las que se encuentra la encefalopatía espogiforme bovina (BSE).
Estos riesgos han conducido recientemente a la Comunidad Europea a prohibir la utilización de proteína hidrolizada de origen animal o derivados para su utilización en la agricultura biológica.
En la literatura se describen tres grupos de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (glicoproteínas-hidroxi-ricas), HRGP), identificadas y caracterizadas en plantas (Showalter AM and Varner JE Biochemistry of plants, vol.15, 1988. Stumpf PK & Conn, Edit. EE Academeic Publisher, New Cork). Éstas comprenden:
proteínas de arabinogalactano, principalmente localizadas en la matriz extracelular y en ocasiones asociadas con la membrana plasmática.
Algunas de estas extensinas de los cultivos celulares de zanahoria se caracterizaron ampliamente por su función importante en el control de la extensión de la pared durante el crecimiento celular (Lamport, 1969; Brysk and Chrispeels, 1972). Más recientemente, se han extraído y caracterizado ampliamente (Averyhart-Fullard et al., 1988; Hong and Nagao, 1989) nuevas proteínas semejantes a las extensinas, que comprenden un 20% de prolina y un 20% de hidroxi-prolina, de la pared celular de la soja en cultivo.
La disolución de HRGP de las paredes celulares fue realizada por múltiples grupos mediante procedimientos análogos. Los primeros trabajos son del 1969, cuando se realizó la primera purificación e identificación de las proteínas unidas a la pared celular (Lamport, 1969). Un procedimiento semejante, basado en la eliminación de las cadenas de azúcar unidas a las glicoproteínas de la pared, con ácido clorhídrico seguido de un tratamiento con tripsina, se aplicó a continuación a cultivos de células de zanahoria para el aislamiento y análisis de los péptidos ricos en hidroxi-prolina derivados de la hidrólisis de las glicoproteínas de la pared (Cho and Chrispeels, 1976).
Los protocolos basados en la tripsinización de las glicoproteínas de la pared también se aplicaron con éxito a cultivos de células de algodón (Qi et al, 1995).
Se purificaron proteínas semejantes a las extensinas a partir de paredes celulares de soja mediante procedimientos basados en tratamientos intensos con ácido tricloroacético, que hidroliza los enlaces glicosídicos de estas glicoproteínas y también permiten su separación de la matriz celulósica, y en consecuencia el aislamiento mediante procedimientos más modernos de HPLC (Averyhart-Fullard et al., 1988). Se utilizaron también tratamientos semejantes con ácidos fuertes y procedimientos de filtración por geles en el aislamiento y caracterización de las extensinas de la pared celular de los cultivos de células de tomate (Brownleader and Dey, 1993).
En la actualidad se conocen pocos estudios orientados solamente a la caracterización de dichas glicoporoteínas y a la verificación experimental de su función en la fisiología vegetal.
La 4-HO-Pro [Plant Physiology (1984), Efects of the proline analog L-tiazolidine-4-carboxílic acid on proline metabolism
, Vol. 74, pags. 213-218, 1984] también es conocida por su capacidad de incremento del nivel de prolina en los tejidos vegetales, reforzando las respuestas naturales de la planta para mitigar/oponerse a los efectos provocados por los agentes de estrés abiótico (por ejemplo, temperaturas extremas, sequía, salinidad del suelo, además de múltiples tipos contaminantes químicos), y también asistir en las respuestas de la planta o en el efecto de los agentes fitoiátricos en el control de los fitopatógenos.
De hecho, La 4-HO-Pro de fuentes animales ya se comercializa con este fin, pero solamente en una mezcla con otros aminoácidos. Para estas aplicaciones, está solamente disponible diluida en productos de proteína hidrolizada y, en particular, productos hidrolizados derivados del tratamiento químico o enzimático de epitelio animal. Esta fuente, sin embargo, tiene un posible riesgo de contaminación debido a la presencia potencial de vectores de la encefalopatía espongiforme bovina (BSA).
En la actualidad se hace necesaria la disponibilidad de fuentes alternativas para la obtención de 4-HO-Pro que reduzcan los riesgos de contaminación biológica.
Uno de los objetivos de la presente invención consiste por lo tanto en proporcionar un procedimiento de obtención de polipéptidos ricos en hidroxi-L-prolina o composiciones enriquecidos en estos polipéptidos, libre de riesgos de contaminación biológica.
Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar polipéptidos ricos en 4-hidroxi-L-prolina o composiciones basadas en estos polipéptidos que se puedan utilizar como productos intermedios en la preparación de otras sustancias químicas.
Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar composiciones a base de polipéptidos ricos en hidroxiprolina que se puedan aplicar en el campo agroquímico y en particular a la agricultura biológica.
A partir de los objetivos anteriores, de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento destinado a la preparación de polipéptidos ricos en 4-hidroxiprolina...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para el aislamiento de polipéptidos ricos en 4-hidroxiprolina, que caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende, entre las etapas c) y d), una etapa de precipitación de las paredes celulares y lavado con el fin de eliminar los componentes citoplasmáticos celulares.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la digestión de las proteínas de las paredes de la etapa f) se realiza alternando la hidrólisis ácida y la hidrólisis enzimática.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende una etapa de separación adicional g) por cromatografía de los péptidos y aminácidos.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho cultivo celular es un cultivo de células de tabaco BY2.
6. Composición a base de polipéptidos ricos en 4-hidroxiprolina obtenidos según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Composición según la reivindicación 6, caracterizada porque comprende una o más unidades de polisacárido.
8. Composición según la reivindicación 7, caracterizada porque dicha unidad de polisacárido es la arabinosa o una fracción de la misma.
9. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el campo de la agronomía con el fin de proporcionar a los cultivos una mayor tolerancia al estrés abiótico y/o biótico.
10. Polipéptidos ricos en 4-hidroxiprolina obtenidos según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.
11. Utilización de polipéptidos ricos en 4-hidroxiprolina según la reivindicación 10, en el campo de la agronomía para proporcionar a los cultivos una mayor tolerancia al estrés abiótico y/o biótico.
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