PROCEDIMIENTO Y COMPOSICIONES PARA USAR EL POLIPÉPTIDO DE CADENA INVARIANTE DE MHC DE CLASE II COMO RECEPTOR PARA EL FACTOR INHIBIDOR DE LA MIGRACIÓN DE MACRÓFAGOS.

Un procedimiento para explorar compuestos para determinar un agonista o antagonista de MIF que comprende:

poner en contacto un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) con MIF en presencia y ausencia de un compuesto candidato, y comparar la interacción del MIF y dicho polipéptido li en presencia de dicho compuesto candidato con su interacción en ausencia de dicho compuesto candidato, por lo que un compuesto candidato que aumenta la interacción de dicho MIF con dicho polipéptido li se identifica como un agonista de MIF, y un compuesto candidato que inhibe la interacción de dicho MIF con dicho polipéptido li se identifica como un antagonista de MIF; en el que dicho polipéptido li comprende la secuencia de aminoácidos completa de li de la Figura 5 (SEC ID Nº: 2) o una fragmento de unión a MIF de la misma

La presente solicitud reivindica los derechos de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos con Nº de Serie 60/279.435, presentada el 29 de marzo de 2001. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para usar el polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II, li (también conocido como CD74), como receptor para el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), incluyendo procedimientos y composiciones para usar este receptor, así como agonistas y antagonistas de MIF que se unen a este receptor o que modulan de otra manera la interacción de MIF con CD74, o las consecuencias de dicha interacción, en procedimientos para el tratamiento de afecciones caracterizadas por niveles de MIF alterados local o sistémicamente, particularmente afecciones inflamatorias y cáncer. Antecedentes de la Tecnología

El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), la primera actividad citocina que se describirá, ha surgido para ser visto como un regulador crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa1-3. El MIF está codificado por un único gen, y los estudios de cristalización han demostrado que MIF define un nuevo plegamiento de proteínas y una nueva superfamilia estructural4. A pesar del hecho de que la actividad biológica atribuida primero al MIF se describió hace casi 30 años, sólo recientemente se ha conocido información en relación con el papel exacto del MIF en la fisiología e inmunidad celular1-9, 18 . El MIF está implicado en el centro de la activación de macrófagos y linfocitos T y en el desarrollo de choque séptico, artritis y otras afecciones inflamatorias2. Además, el MIF se ha asociado con cáncer32 .

El MIF está implicado de forma crítica en la expresión de la inmunidad innata y adquirida. El MIF se libera por una diversidad de tipos celulares y es un factor necesario para la activación de respuestas proliferativas de macrófagos18 , linfocitos T6 y fibroblastos7, los efectos mitogénicos del MIF se desarrollan a través de una ruta de activación autocrina/paracrina que implica a la cascada de proteínas quinasas activadas por mitógeno p44/p42 (ERK-1/2). Los ratones MIF -/-son muy resistentes al choque endotóxico3, y la inmunoneutralización del MIF confiere protección frente al choque séptico25 y una diversidad de patologías inmunoinflamatorias tales como hipersensibilidad de tipo retardado26 , artritis27 y glomerulonefritis28 . Las acciones del MIF sobre las células también muestran varias características únicas. Éstas incluyen una acción contrarreguladora global sobre la inmunosupresión inducida por glucocorticoides5, 6, la inducción de un patrón sostenido de activación de ERK-1/27 y el antagonismo funcional de la apoptosis dependiente de p536.

Las propiedades proinflamatorias del MIF se han asociado a su capacidad para contrarregular los efectos inmunosupresores de los glucocorticoides5, 6, y se ha supuesto que sus interacciones con células requieren un mecanismo de acción basado en receptor7, 8 o reflejan un modo de acción intracelular especializado9. Numerosos estudios in vitro e in vivo han concordado con que el MIF actúe por acoplamiento de un receptor de superficie celular, sin embargo, la ausencia de progresos hacia la identificación de receptores candidatos ha provocado interés en modos de acción intracelulares especializados9 o en el papel biológico potencial de la actividad tautomerasa del MIF2, 21. También hay pruebas de que el MIF pueda funcionar como una isomerasa4.

Se ha establecido que la cadena invariante asociada a MHC de clase II, li (CD74)10 , desempeña un papel importante en el procesamiento y el transporte de proteínas de MHC de clase II del retículo endoplásmico al aparato de Golgi10. La mayor parte de li se disocia del complejo de clase II como carga de péptidos antigénicos sobre sus sitios de unión de clase II. Aproximadamente el 2-5 % de la li celular total se expresa también en la superficie celular17 , donde se ha demostrado que funciona como una molécula accesoria para la activación de linfocitos T11. li se ha implicado previamente en la señalización y las funciones auxiliares para la activación de células inmunes11-13 .

La Patente de Estados Unidos Nº 5.559.028 de Humphreys y col. desvela construcciones génicas para la expresión de cadenas de li de tipo silvestre y mutantes en células recombinantes. La Patente de Estados Unidos Nº 5.726.020 de Humphreys y col. desvela y reivindica construcciones génicas inversas expresables y oligonucleótidos que hibridan con una molécula de ARNm de li, inhibiendo de esta manera la traducción de la molécula de ARNm de li.

El documento US 6 030 615 (Bucala y col.) desvela antagonistas del MIF que son anticuerpos anti-MIF neutralizantes, junto con anticuerpos anti-receptor de MIF y receptores de MIF solubles, que neutralizan la actividad biológica del MIF. Este documento también desvela moléculas antisentido y ribozimas que impiden o reducen la expresión de MIF. No se desvela la naturaleza del receptor de MIF. El documento WO 98/17314 (The Pivower Institute for Medical Research) describe anticuerpos anti-MIF neutralizantes y moléculas antisentido para el tratamiento del cáncer. El documento WO 00/74718 (Immunomedics, Inc.) describe anticuerpos dirigidos contra CD74. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se basa, en parte, en la identificación, usando la expresión, clonación y análisis funcionales, de que el polipéptido de cadena invariante asociado a Clase II, li (o CD74)10 es un receptor celular para MIF. Por lo tanto, MIF se une al dominio extracelular de li, una proteína de membrana de Tipo II, y li es necesario para la activación celular inducida por MIF y/o cambios fenotípicos incluyendo, por ejemplo, la señalización a través de la cascada de MAP quinasas (ERK)-1/2 de quinasas relacionadas con señales extracelulares y la proliferación celular. La relación de la invención proporciona un mecanismo para la actividad del MIF como citocina y lo identifica como un ligando natural para li, que se ha implicado previamente en la señalización y funciones auxiliares para la activación de células inmunes.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a procedimientos para explorar compuestos para identificar moduladores positivos o negativos de la unión de MIF, o de la actividad en relación con la unión a CD74. Por lo tanto, en un primer caso, la presente invención proporciona un procedimiento para explorar compuestos para determinar un agonista

o un antagonista de MIF que comprende: poner en contacto un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) con MIF en presencia y ausencia de un compuesto candidato y comparar la interacción del MIF y dicho polipéptido li en presencia de dicho compuesto candidato con su interacción en ausencia de dicho compuestos candidato, por lo que un compuesto candidato que aumenta la interacción de dicho MIF con dicho polipéptido li se identifica como un agonista de MIF, y un compuesto candidato que inhibe la interacción de dicho MIF con dicho polipéptido li se identifica como un antagonista de MIF; en el que dicho polipéptido li comprende la secuencia de aminoácidos completa de li de la Figura 5 (SEC ID Nº: 2) o un fragmento de unión a MIF del mismo.

Dicho procedimiento puede comprender un ensayo de unión bioquímico (es decir acelular), que comprende: poner en contacto un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) con MIF en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo, y comparar la interacción de unión del MIF y polipéptidos li en presencia del compuesto de ensayo con su interacción en ausencia del compuesto de ensayo, por lo que un compuesto que modula positivamente la interacción del MIF con el polipéptido li se identifica como un potenciador de la actividad de unión de MIF y un compuesto que modula negativamente la interacción del MIF con el polipéptido li se identifica como un inhibidor de la actividad de unión del MIF. Los potenciadores identificados de esta manera son agonistas terapéuticos candidatos o potenciadores de MIF, mientras que los inhibidores identificados de este modo son antagonistas terapéuticos candidatos de MIF. Por ejemplo, un compuesto de ensayo puede reforzar la unión del MIF al polipéptido li (es decir, aumentar la afinidad de la interacción) y por lo tanto aumentar la interacción del MIF y el polipéptido li. Dicho potenciador se identifica por lo tanto como un agonista o potenciador de MIF, y se identifica como un agente terapéutico candidato para aumentar, independientemente de o en relación...

1. Un procedimiento para explorar compuestos para determinar un agonista o antagonista de MIF que comprende: poner en contacto un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) con MIF en presencia y ausencia de un compuesto candidato, y comparar la interacción del MIF y dicho polipéptido li en presencia de dicho compuesto candidato con su interacción en ausencia de dicho compuesto candidato, por lo que un compuesto candidato que aumenta la interacción de dicho MIF con dicho polipéptido li se identifica como un agonista de MIF, y un compuesto candidato que inhibe la interacción de dicho MIF con dicho polipéptido li se identifica como un antagonista de MIF; en el que dicho polipéptido li comprende la secuencia de aminoácidos completa de li de la Figura 5 (SEC ID Nº: 2) o una fragmento de unión a MIF de la misma.

2. Uso de un antagonista de MIF en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio o una enfermedad infecciosa por inhibición de un efecto de MIF sobre una célula que comprende en su superficie extracelular un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) que se une a MIF y, por lo tanto, media dicho efecto secundario de MIF, inhibiendo dicho antagonista la unión de MIF a dicho polipéptido li, seleccionándose el antagonista del grupo que consiste en anticuerpo anti-CD74 humano, un anticuerpo anti-CD74 humanizado, un anticuerpo anti-CD74 quimérico, un polipéptido li soluble y un fragmento de unión a MIF soluble de un polipéptido li soluble.

3. Uso de un antagonista de MIF en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer por inhibición de un efecto de MIF sobre una célula que comprende en su superficie celular un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) que se une a MIF y por lo tanto media dicho efecto de MIF, inhibiendo dicho antagonista la unión de MIF a dicho polipéptido li, seleccionándose el antagonista del grupo que consiste en anticuerpo anti-CD74 humano, un anticuerpo anti-CD74 humanizado, un anticuerpo anti-CD74 quimérico, un polipéptido li soluble y un fragmento de unión a MIF soluble de un polipéptido li soluble.

4. Un antagonista de MIF para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, una enfermedad infecciosa o cáncer mediante la inhibición de un efecto de MIF sobre una célula que comprende en su superficie extracelular un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) que se une a MIF y, por lo tanto, media dicho efecto de MIF, inhibiendo dicho antagonista la unión de MIF a dicho polipéptido li, seleccionándose el antagonista del grupo

que consiste en anticuerpo anti-CD74 humano, un anticuerpo anti-CD74 humanizado, un anticuerpo anti-CD74 quimérico, un polipéptido li soluble y un fragmento de unión a MIF soluble de un polipéptido li soluble.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 2 o un antagonista de acuerdo con la reivindicación 4 para el tratamiento de un trastorno inflamatorio que es choque séptico.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 3 o un antagonista de acuerdo con la reivindicación 4 para el tratamiento de un trastorno inflamatorio que es artritis.

7. Uso de un antagonista de MIF en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio o una enfermedad infecciosa por contacto, extracelularmente, del MIF con un antagonista de MIF, en el que dicho antagonista de MIF comprende un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) o un fragmento del mismo que se une a MIF.

8. Uso de un antagonista de MIF en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer por contacto, extracelularmente, del MIF con un antagonista de MIF, en el que dicho antagonista de MIF comprende un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) o un fragmento del mismo que se une a MIF.

9. Un antagonista de MIF para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, una enfermedad infecciosa o cáncer por contacto, extracelularmente, del MIF con un antagonista de MIF, en el que dicho antagonista de MIF comprende un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) o un fragmento del mismo que se une a MIF.

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8 o un antagonista de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li)

o fragmento del mismo que se une a MIF es una forma soluble de dicho polipéptido o fragmento del mismo.

11. Uso de un antagonista de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha forma soluble de dicho polipéptido o fragmento del mismo comprende el domino de unión extracelular de dicho polipéptido o una parte del mismo.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 7 o un antagonista de acuerdo con la

reivindicación 9, para el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

13. Uso de un antagonista de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el trastorno es choque séptico.

14. Uso de un antagonista de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el trastorno es artritis.

15. Un procedimiento para purificar MIF que comprende: poner en contacto una muestra que comprende MIF con un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) o un fragmento del mismo que se une a MIF en condiciones que promueven la unión específica de MIF al polipéptido li o fragmento del mismo, y separar el complejo de MIF:polipéptido li o el complejo de MIF:fragmento de polipéptido li formado de esta manera de materiales que no se unen al polipéptido li o fragmento del mismo.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido li o fragmento del mismo se inmoviliza en una matriz de soporte sólido.

17. Un procedimiento para ensayar la presencia de MIF que comprende: poner en contacto una muestra con un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) o un fragmento del mismo que se une a MIF en condiciones que promueven la unión específica de MIF a dicho polipéptido li o un fragmento del mismo, y detectar cualquier complejo de MIF:polipéptido li o complejo de MIF:fragmento de polipéptido li formado de esta manera.

18. Un procedimiento in vitro para reducir un efecto del MIF sobre una célula que comprende en su superficie un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) que se une a MIF y de esta forma media dicho efecto del MIF, comprendiendo dicho procedimiento: proporcionar a dicha célula una molécula de ácido nucleico antisentido en una cantidad efectiva para reducir la cantidad de dicho polipéptido li producido por dicha célula, en el que dicha molécula de ácido nucleico antisentido se une específicamente a una porción del ARNm expresado a partir de un gen que codifica dicho polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) y de esta forma reduce la traducción de dicho ARNm en dicha célula.

19. El uso de una molécula de ácido nucleico antisentido en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio, enfermedad infecciosa o cáncer

por reducción de un efecto del MIF sobre una célula que comprende en su superficie un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) que se une a MIF y de esta forma media dicho efecto del MIF, en el que dicha molécula de ácido nucleico antisentido se une específicamente a una porción del ARNm expresado a partir de un gen que codifica dicho polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) y de esta forma reduce la traducción de dicho ARNm en dicha célula.

20. Una molécula de ácido nucleico antisentido para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, enfermedad infecciosa o cáncer mediante la reducción de un efecto del MIF en una célula que comprende en su superficie un polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) que se une a MIF y de esta forma media dicho efecto del MIF, en el que dicha molécula de ácido nucleico antisentido se une específicamente a una porción del ARNm expresado a partir de un gen que codifica dicho polipéptido de cadena invariante de MHC de clase II (li) y por lo tanto reduce la traducción del ARNm en dicha célula.

21. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el medicamento es una composición farmacéutica.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 19 o una molécula de ácido nucleico antisentido de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha molécula de ácido nucleico antisentido está en forma de un oligonucleótido.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 19 o una molécula de ácido nucleico antisentido de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha molécula de ácido nucleico antisentido está en forma de una construcción recombinante que expresa dicha molécula de ácido nucleico antisentido en dicha célula.