Procedimiento in vitro para evaluar la eficacia ADCC mediada por el CD16 de un anticuerpo monoclonal o policlonal,

que comprende la puesta en contacto de células efectoras Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia de dicho anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo, y una medición de la cantidad de IL-2 producida por las células efectoras Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16, caracterizado porque la secreción de IL-2 por las células Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 está correlacionada con la actividad ADCC mediada por el CD16

La presente solicitud se refiere a un procedimiento para medir la activación de una célula efectora, que pertenece al sistema inmunitario o modificada in vitro mediante un anticuerpo monoclonal (AcMo) o policlonal, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia del anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo y una medición de la calidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16. La solicitud se refiere asimismo a la selección de anticuerpos que presentan la característica de inducir la expresión de citoquinas y de interleucinas, en particular el IFNγ o la IL2.

La inmunoterapia con la ayuda de anticuerpos policlonales o monoclonales está a punto de convertirse en uno de los aspectos más importantes de la medicina. Por el contrario, los resultados obtenidos durante los ensayos clínicos aparecen contrastados. En efecto, puede resultar que el anticuerpo monoclonal no sea suficientemente eficaz. En la actualidad, las investigaciones se orientan al fragmento Fcγ de la inmunoglobulina con el fin de mejorar las propiedades de los anticuerpos. En el futuro, esto debería permitir la obtención de anticuerpos que interactúan y que activan los receptores de las células efectoras (macrófago, linfocito T y NK).

La actividad biológica de ciertas inmunoglobulinas G es dependiente de la estructura de los oligosacáridos presentes en la molécula, y en particular en su parte Fc. Las moléculas IgG de todas las sub-clases humanas y murinas poseen un N-oligosacárido fijado al dominio CH2 de cada cadena pesada (en el residuo Asn 297 para las IgG humanas). Se ha demostrado la influencia de este residuo glicánico sobre la capacidad del anticuerpo para interactuar con unas moléculas efectoras (Fc receptores y complemento). La inhibición de glicosilación de una IgG1 humana, mediante el cultivo en presencia de Tunicamicina, provoca por ejemplo una disminución de 50 veces de la afinidad de este anticuerpo para el receptor FcγRI presente sobre los monocitos y macrófagos (Leatherbarrow et al., 1985). La fijación al receptor FcγRIII está afectada asimismo por la pérdida de carbohidratos sobre la IgG, puesto que se ha descrito que una IgG3 no glicosilada es capaz de inducir una lisis de tipo ADCC por medio del receptor FcγRIII de las células NK (Lund et al., 1990).

Sin embargo, más allá de la presencia necesaria de estos residuos glicánicos, es más precisamente la heterogeneidad de su estructura lo que puede ocasionar unas diferencias en la capacidad para activar unas funciones efectoras. Se han observado unos perfiles de galactosilación variables en función de los individuos (IgG1 humanas séricas). Estas diferencias reflejan probablemente unas disparidades en la actividad de las galactosiltransferasas y otras enzimas entre los clones celulares de estos individuos (Jefferis et al., 1990). Mientras que esta heterogeneidad normal de los procesos post-traduccionales genera diferentes glicoformas (incluso en el caso de anticuerpos monoclonales), puede conducir a unas estructuras atípicas asociadas a ciertos estados patológicos tales como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, para los cuales se ha demostrado una proporción importante de los residuos agalactosilados (Parekh et al., 1985).

Frente a la complejidad planteada por la relación existente entre las diferentes estructuras glicánicas y la actividad de los anticuerpos, sería útil poder discriminar rápidamente cuáles son los anticuerpos eficaces y permitir así seleccionar unas líneas celulares que producen unos anticuerpos que tienen una mejor eficacia o unas propiedades específicas en la activación o en la inhibición de ciertos componentes del sistema inmunitario.

En la solicitud FR 0004685 del 12 de abril de 2000 (LFB), se describió un nuevo procedimiento de preparación de un anticuerpo monoclonal capaz de activar las células efectoras que expresan el FcγRIII. En este procedimiento, se ensayan unos anticuerpos monoclonales que proceden de hibridomas o de líneas transfectadas en una mezcla de reacción que comprende las células diana de dichos anticuerpos, unas células efectoras que comprenden unas células que expresan el FcγRIII y unas IgG polivalentes. Así, se puede determinar el porcentaje de lisis de las células diana y seleccionar unos anticuerpos monoclonales que activan las células efectoras que provocan una lisis significativa de las células diana (actividad ADCC de tipo FcγRIII). Por ejemplo, la parte Fab del anticuerpo anti-D se fijará sobre el antígeno Rhesus D contenido por los hematíes. A consecuencia de esta fijación, su parte Fc se fija entonces sobre el receptor Fc gamma RIII o CD16 de la célula efectora (célula NK). Este "sándwich" induce la secreción de sustancias químicas de tipo perforinas que lisarán el glóbulo rojo. Se trata por lo tanto de una citotoxicidad celular anticuerpo dependiente (CCDA) o ADCC en inglés. Para acercarse de las condiciones fisiológicas, el ensayo se efectúa en presencia de inmunoglobulinas polivalentes humanas.

En el marco de la invención, se ha descubierto que la fijación de un anticuerpo sobre su ligando puede inducir una activación de la célula Jurkat transfectada CD16 que induce la secreción de IL2. Se observa una fuerte correlación entre la secreción de IL2 por Jurkat CD16 y la actividad ADCC mediada por el CD16 de las células efectoras. Además, se ha observado que un mismo anticuerpo dirigido contra un antígeno dado es completamente ineficaz cuando está producido en unas líneas de mieloma de ratón, mientras que se muestra muy eficaz cuando está producido en otras líneas celulares.

El problema es por lo tanto saber cuál es la capacidad de un anticuerpo dado para estimular la producción de citoquinas por las células efectoras y cuáles son las consecuencias de dicha activación en función de la naturaleza de las citoquinas liberadas.

La solicitud propone por lo tanto la utilización de anticuerpos seleccionados por un ensayo Jurkat CD16 mediante la medición de IL2 segregada o de otras citoquinas, lo cual permite garantizar la actividad biológica de dichos anticuerpos para un uso terapéutico.

Descripción

La invención es tal como se describe en las reivindicaciones.

La presente solicitud se refiere a un procedimiento para medir la activación de una célula efectora que pertenece al sistema inmunitario, transformada o no, por un anticuerpo monoclonal (AcMo) o policlonal, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia del anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo y una medición de la cantidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16.

Mediante la expresión "célula transformada" se entiende una célula modificada genéticamente, de manera que exprese un receptor, en particular el receptor CD16.

De manera más general, se utiliza para la selección de los anticuerpos una línea de tipo Jurkat u otra línea transfectada con un vector de expresión que codifica para un receptor Fc, incluyendo CD16, CD32 y CD64, como célula efectora. Preferentemente, se utiliza una línea Jurkat transfectada con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 como célula efectora. Esta línea es particularmente ventajosa puesto que es inmortalizada y se desarrolla indefinidamente en unos medios de cultivo.

Entre las citoquinas que se pueden cuantificar, es posible medir la producción de por lo menos una citoquina seleccionada de entre IL1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, etc. TNFa, TGFβ, IP10 e IFNγ. Se puede seleccionar ventajosamente la interleucina IL-2.

El porcentaje de citoquina producida es un marcador de activación o de inhibición de las células efectoras.

Preferentemente, el porcentaje de interleucina IL2 segregada refleja la calidad del anticuerpo fijado por el receptor CD16 en cuanto a su integridad (función Fc) y a su eficacia (sitio antigénico) de unión al antígeno. La medición del porcentaje de IL2 está correlacionada con una actividad de tipo ADCC.

En otro aspecto, la solicitud se refiere a un procedimiento para evaluar la eficacia de un anticuerpo monoclonal o policlonal, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células efectoras del sistema inmunitario, transformadas o no, que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para evaluar la eficacia ADCC mediada por el CD16 de un anticuerpo monoclonal o policlonal, que comprende la puesta en contacto de células efectoras Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia de dicho anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo, y una medición de la cantidad de IL-2 producida por las células efectoras Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16, caracterizado porque la secreción de IL-2 por las células Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 está correlacionada con la actividad ADCC mediada por el CD16.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o monoclonal de especificidad anti-Rh D del glóbulo rojo humano.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque comprende además una etapa de

15 selección de los anticuerpos para los cuales se observa un aumento superior a 100%, 250%, 500% o 1.000% del porcentaje de liberación de IL-2 con respecto al control en ausencia de anticuerpos o en presencia de un anticuerpo dado como referencia negativa.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la mezcla de reacción comprende 20 inmunoglobulinas humanas (IVIg).