EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE LA CITOCINA EN CÁNCER HUMANO.

La invención se refiere a un método para diagnosticar un tipo de cáncer, mediante el cual se determina la expresión de citocinas antiapoptóticas en las células tumorales. El diagnóstico diferencial de la presente invención se usa para clasificar trastornos tumorales y para recomendar el tratamiento requerido y monitorizar el progreso y respuesta al tratamiento. El balance entre la supervivencia celular y la muerte celular está controlado por factores proapoptóticos y antiapoptóticos, cuya desregulación contribuye al desarrollo de varias afecciones patológicas, incluyendo cáncer. Habitualmente se encuentra una expresión elevada de factores antiapoptóticos en cánceres humanos, y contribuyen tanto a la expansión celular neoplásica como a la resistencia a la acción terapéutica de fármacos citotóxicos. Ya se ha dado a conocer que la producción autocrina de citocinas antiapoptóticas por células tumorales modula fuertemente la susceptibilidad a la apoptosis inducida por el receptor y por quimioterapia. En particular, se ha dado a conocer previamente que IL-4 e IL-10 actúan como factor de crecimiento autocrino en células cancerosas, induciendo aumento de proteínas antiapoptóticas, que protegen a las células tumorales de la muerte inducida por fármacos quimioterapéuticos (Stassi et al., Cancer Res. 63, 6784-90 (2003), Todaro et al., Cancer Res. 66, 1491-9 (2006)). Los tumores están compuestos de una combinación heterogénea de células, con diferentes características terapéuticas y diferentes potenciales proliferativos. En particular, las células cancerosas pueden dar lugar a una progenie fenotípicamente diversa de células, ya sea dotadas con un potencial proliferativo definido o que tienen un potencial proliferativo limitado o no proliferativo. A este respecto, pruebas recientes sugieren que la capacidad de crecimiento tumorigénico está confinada de hecho a un pequeño subconjunto de las denominadas células madre cancerosas (CSC). La Solicitud Internacional PCT/IT2005/000523 describe un método para aislar y cultivar células madre a partir de tumores sólidos. Esta subpoblación de células cancerosas se puede autorrenovar y puede dar lugar a una población de células heterogéneas que muestran diversos grados de diferenciación. Además, se ha encontrado recientemente que estas células madre cancerosas son significativamente resistentes a apoptosis inducida por fármacos, escapando así de las terapias antitumorales y siendo esto probablemente la razón subyacente para la ineficiencia quimioterapéutica. Hassuneh et al. (Blood, vol. 89, p. 610-320, 1997) describen pruebas de la participación de IL-2 e IL-4 en la regulación de crecimiento autónomo y tumorigénesis de células transformadas de origen linfoide. Alas et al. (Clin. Canc. Res. Vol. 7, p. 709-723, 2001) se refiere a la inhibición de IL-10 por Rituximab, dando como resultado la disminución de Bcl-2 y una sensibilización del linfoma no de Hodgkin de células B a la apoptosis. Czarneski et al. (Leukemia, Vol. 18, p. 597-606, 2004) describe estudios en ratones NZB a los que se les ha inactivado el gen de IL-10 de la necesidad de IL-10 para la progresión de linfoma de células B. La patente US nº 6.548.655 se refiere a los receptores de IL-4, IL-4R, y a la administración de IL-4R soluble, siendo las aplicaciones clínicas la terapia contra la alergia y la terapia para el transplante, así como la supresión de hipersensibilidad de tipo retrasada o de contacto. El documento WO 96/04388 se refiere a antagonistas de IL-4 y/o IL-13 humanas para el tratamiento de por ejemplo enfermedades alérgicas mediadas por IgE. Kruse et al. (Int. Immunol., vol. 11, p. 1965-1969, 1999) describe la caracterización de la forma unida a la membrana y de una forma soluble del receptor de IL-4 humano producido por corte y empalme alternativo. Borish et al. (Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 160, p. 1816-1823, 1999) se refiere a un ensayo clínico relacionado con el receptor de IL-4 en asma atópica moderada. Ahora se ha demostrado que las CSC producen predominantemente IL-4 e IL-10, y son responsables de la alteración mencionada anteriormente de la sensibilidad a la muerte celular inducida por fármacos. Ahora también se ha encontrado por los inventores de la presente invención que los tumores epiteliales se pueden diferenciar en cuanto al nivel y/o perfil de expresión de citocinas antiapoptóticas. La expresión de citocinas antiapoptóticas difiere entre tumores individuales del mismo órgano, e incluso en células o porciones de un único tumor. Estos resultados conducen a nuevas estrategias eficientes en el diagnóstico y/o terapia de tumores. En particular, un objeto de la presente invención fue proporcionar un método que permite la identificación y diagnóstico de tipos de cáncer y células cancerosas que expresan citocinas antiapoptóticas. 2   La presente invención se define por el conjunto anejo de reivindicaciones. En consecuencia, la presente invención proporciona un método para diagnosticar tipos de tumores epiteliales, usando como diana las citocinas antiapoptóticas IL-4 y/o IL-10. Particularmente, la invención se refiere a un método para diagnosticar un tipo de cáncer según la reivindicación 1. Por tanto, la invención se refiere al diagnóstico diferencial de tipos de cáncer por medio de la determinación y/o cuantificación del perfil y/o nivel de expresión de citocinas antiapoptóticas en la muestra tumoral, en el que las citocinas antiapoptóticas son IL-4 y/o IL-10, particularmente IL-4. Si no se especifica adicionalmente, las citocinas antiapoptóticas aquí son IL-4 y/o IL-10. El diagnóstico diferencial según la invención permite clasificar tipos tumorales e identificar aquellos que muestran expresión de citocinas antiapoptóticas y que son refractarios al tratamiento con agentes quimioterapéuticos. Por tanto, la expresión de citocinas antiapoptóticas es un marcador significativo para la clasificación tumoral, que permite una selección de estrategias terapéuticas buscadas como dianas. Por ejemplo, el método de la invención puede ser útil para predecir si un paciente que sufre cierto tipo de cáncer sería resistente o susceptible a cierta terapia, y para proporcionar una estrategia de tratamiento optimizado. Según la presente invención, se encontró que los tipos de cáncer se pueden clasificar como tumores que no expresan citocinas, o como tumores que expresan citocinas. Cuando se determina la expresión de IL-4 y/o IL-10, más particularmente la expresión de IL-4, los tumores epiteliales se clasifican con relación a su expresión de sólo IL-4 o sólo IL-10, o tanto IL-4 como IL-10. Por lo tanto, el método según la presente invención permite la diferenciación entre tumor epitelial clasificado como tumores que expresan IL-4 o tumores que no expresan IL-4, tumor epitelial clasificado como tumores que expresan IL-10 o tumores que no expresan IL-10, y tumor epitelial clasificado como tumores que expresan IL-4 e IL-10 o tumores que no expresan IL- 4 y no expresan IL-10. El método de la presente invención se lleva a cabo preferiblemente sobre tumores epiteliales. Dichos tumores epiteliales se pueden escoger del grupo que consiste en cáncer de tiroides, de mama, de próstata, de vejiga, de colon, gástrico, de páncreas, de riñón, de hígado y de pulmón. Más preferiblemente, el tumor epitelial es un cáncer de colon, gástrico, de mama, de pulmón, de vejiga o de próstata. El método diagnóstico de la presente invención se puede llevar a cabo sobre diversas muestras celulares procedentes de un tumor epitelial. La muestra de ensayo es preferiblemente una muestra celular procedente de tumor primario y/o del entorno tumoral aislado de un sujeto, por ejemplo un paciente humano. Por ejemplo, se puede ensayar el tejido celular tumoral obtenido mediante biopsia, resección u otras técnicas. La muestra tumoral comprende células tumorales. La expresión de citocina antiapoptótica en las células tumorales se determina preferiblemente sobre células tumorales primarias y/o células madre cancerosas. Los métodos para la determinación de la expresión de citocinas antiapoptóticas en células tumorales son bien conocidos en la técnica. La determinación de la expresión, en particular de la sobreexpresión, de la citocina antiapoptótica en la célula tumoral se lleva a cabo mediante la detección de dicha citocina a nivel de proteínas y/o a nivel de ácidos nucleicos. La determinación de proteínas citocínicas se puede llevar a cabo en células tumorales o en el microentorno tumoral. Los métodos para determinar la presencia y cantidad de proteínas citocínicas en una muestra dada son bien conocidos por la persona experta en la técnica, y pueden ser métodos inmunoquímicos tales como métodos de inmunohistoquímica, transferencia Western, inmunoprecipitación y ELISA. Se pueden... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para diagnosticar un tipo de cáncer, que comprende las etapas: (a) proporcionar una muestra procedente de un tumor epitelial que comprende células tumorales, (b) determinar la expresión de al menos una citocina antiapoptótica en dichas células tumorales, y (c) clasificar el tumor epitelial como un tumor que no expresa citocinas o como un tumor que expresa citocinas, en el que la citocina antiapoptótica es IL-4 y/o IL-10, en el que el tumor epitelial se clasifica como un tumor que expresa IL-4, un tumor que no expresa IL-4, un tumor que expresa IL-10, un tumor que no expresa IL-10, un tumor que expresa IL-4 e IL-10, o como un tumor que no expresa IL-4 y no expresa IL-10. 2. El método in vitro según la reivindicación 1, en el que el tumor epitelial se selecciona del grupo de cáncer de tiroides, de mama, de próstata, de vejiga, de colon, gástrico, de páncreas, de riñón, de hígado y de pulmón. 3. El método in vitro según la reivindicación 2, en el que el tumor es preferiblemente un cáncer de colon, gástrico, de mama, de pulmón, de vejiga, o de próstata. 4. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células tumorales son células tumorales primarias y/o células madre cancerosas. 5. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección de la expresión de citocinas antiapoptóticas en las células tumorales comprende una detección a nivel de proteínas y/o a nivel de ácidos nucleicos, preferiblemente: (a) una detección a nivel de proteínas, que comprende la detección de la citocina antiapoptótica, preferiblemente con métodos inmunoquímicos y/o espectrométricos de masas, o (b) una determinación a nivel de ácidos nucleicos, que comprende la determinación de los niveles de expresión de ARNm de la citocina antiapoptótica con métodos de hibridación de ácidos nucleicos y opcionalmente amplificación, preferiblemente con métodos de RT-PCR. 6. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además las etapas de (d) determinar la sensibilidad de las células de un tumor que expresa citocinas frente a al menos un agente quimioterapéutico o proapoptótico en presencia y/o en ausencia de un antagonista de dicha citocina expresada, y/o su receptor, preferiblemente determinando un agente quimioterapéutico o proapoptótico frente al cual son sensibles las células del tumor que expresa citocinas, y (e) opcionalmente seleccionar un tratamiento específico para el tipo de cáncer, preferiblemente seleccionar un tratamiento que comprende la administración de una combinación de un agente neutralizante de citocinas y un agente quimioterapéutico o apoptótico, en el que el agente neutralizante de citocinas es un agente neutralizante de IL-4 y/o IL-10, en el que el agente neutralizante de citocinas es un agente neutralizante de IL- 4 o IL-4 e IL-10. 7. El método in vitro según la reivindicación 6, en el que el agente quimioterapéutico se selecciona de antimetabolitos, agentes que fragmentan el ADN, agentes de reticulación del ADN, agentes intercalantes, inhibidores de la síntesis proteica, inhibidores de las topoisomerasas I y II, agentes dirigidos contra los microtúbulos, inhibidores de cinasas, hormonas y antagonistas de hormonas, o en el que el agente proapoptótico se selecciona de TRAIL y el ligando CD95. 8. El método in vitro según la reivindicación 7, en el que el agente quimioterapéutico se selecciona de cisplatino, carboplatino y oxaliplatino. 9. El método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el agente neutralizante de citocinas es un anticuerpo anti-IL-4 y/o un anticuerpo anti-IL-10, o un fragmento de unión a antígenos del mismo. 10. El método in vitro según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo anti-IL-4 es un anticuerpo derivado de la célula de hibridoma ECACC 93100620, o un fragmento de unión a antígenos de la misma. 11. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el agente neutralizante de citocinas es un polipéptido del receptor soluble de IL-4 o un polipéptido de fusión. 14   12. Una combinación de (i) al menos un agente neutralizante de citocinas, y (ii) al menos un agente quimioterapéutico o proapoptótico, agente proapoptótico el cual se selecciona de TRAIL o CD95L, para uso en un método para el tratamiento de tumores epiteliales que se han hecho refractarios a agentes quimioterapéuticos, en la que el agente neutralizante de citocinas es un agente neutralizante de IL-4 que inhibe la actividad de la proteína citocínica expresada. 13. Una combinación de (i) al menos un agente neutralizante de citocinas, y (ii) al menos un agente quimioterapéutico o proapoptótico, agente proapoptótico el cual se selecciona de TRAIL o CD95L, para uso en un método para el tratamiento de un tumor epitelial que expresa citocinas, en la que el agente neutralizante de citocinas es un agente neutralizante de IL-4 que inhibe la actividad de la proteína citocínica expresada. 14. La combinación de la reivindicación 13, para uso en un método como se define en la reivindicación 13, en combinación con cirugía y/o terapia de irradiación. 15. Una combinación de (i) al menos un agente neutralizante de citocinas, y (ii) al menos un agente quimioterapéutico o proapoptótico, agente proapoptótico el cual se selecciona de TRAIL o CD95L, para uso en un método para el tratamiento de un tumor epitelial que expresa citocinas, en la que la administración de (i) y (ii) se comienza simultáneamente; o en la que la administración de (i) y (ii) se comienza por etapas, en la que el agente neutralizante de citocinas es un agente neutralizante de IL-4 que inhibe la actividad de la proteína citocínica expresada. 16. La combinación según la reivindicación 15, para uso en un método como se define en la reivindicación 15, en la que el comienzo de la administración de (i) es 1 semana antes de (ii), o en la que el comienzo de la administración de (ii) es 1 semana antes de (i). 17. Un receptor alfa de IL-4 soluble humano (número de acceso de NCBI NP_000409), que termina C-terminalmente en el aminoácido 230, 229, 228, 227, 226, 225 ó 224, para uso en un método para el tratamiento de tumores epiteliales. 18. Un polipéptido del receptor de IL-4 soluble, que comprende un dominio del receptor de IL-4 extracelular acortado C-terminalmente que comprende al menos un dominio adicional, en el que el dominio adicional es un dominio extracelular del receptor de IL-13, para uso en un método para el tratamiento de tumores epiteliales.   16   17   18   19     21   22   23   24     26   27   28   29     31   32   33   34