NUEVAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE TROMBOMODULINA DIRIGIDAS HACIA EL FACTOR TISULAR COMO AGENTES ANTICOAGULANTES.

Una proteína de fusión anticoagulante, que comprende una proteína directora hacia diana o un análogo,

un fragmento, un derivado o una variante de la misma, que se fija al factor tisular (TF) o al complejo de factor VIIa/factor tisular (FVIIa/TF), que está ligado operativamente al dominio EGF456 de la trombomodulina (TM), o a un análogo, un fragmento, un derivado o una variante del mismo; fijándose la proteína de fusión anticoagulante al factor tisular (TF) o al complejo de factor VIIa/TF (FVIIa/TF)

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/013522.

Solicitante: BAYER SCHERING PHARMA AKTIENGESELLSCHAFT.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: MULLERSTRASSE 178 13353 BERLIN ALEMANIA.

Inventor/es: LIGHT, DAVID, MCLEAN,KIRK.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 30 de Abril de 2003.

Fecha Concesión Europea: 13 de Octubre de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/485 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factor de crecimiento epidérmico (EGF) (urogastrona).
  • C07K14/745B
  • C07K16/36 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra factores de coagulación sanguínea.
  • C07K16/40 C07K 16/00 […] › contra enzimas.
  • C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).

Clasificación PCT:

  • A61K39/395 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • C07K14/485 C07K 14/00 […] › Factor de crecimiento epidérmico (EGF) (urogastrona).
  • C07K14/745 C07K 14/00 […] › Factores de coagulación sanguínea o de fibrinolisis.
  • C07K16/28 C07K 16/00 […] › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
  • C07K16/40 C07K 16/00 […] › contra enzimas.
  • C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
  • C12N15/13 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Inmunoglobulinas.

Clasificación antigua:

  • A61K38/19 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Citoquinas; Linfoquinas; Interferones.
  • C07K14/52 C07K 14/00 […] › Citoquinas; Linfoquinas; Interferones.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.


Fragmento de la descripción:

ANTECEDENTES 5

Mantener el equilibrio apropiado entre las actividades procoagulante y anticoagulante dentro de los vasos sanguíneos es esencial para una hemóstasis normal (Davie, E.W. y colaboradores (1991) Biochemistry, 30(43):10363-10370). Perturbar el equilibrio hacia la 10 coagulación conduce a una trombosis, lo cual puede causar ataques cardiacos, apoplejía, embolismo pulmonar y trombosis venosa. Existe una necesidad de agentes anticoagulantes más efectivos y seguros para el tratamiento de trastornos trombóticos específicos. 15

El factor tisular (“TF”) es una glicoproteína transmembranal que es el iniciador principal de la cascada de coagulación (Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost 74(1):180-184). En condiciones fisiológicas normales, el TF activo no está en contacto con la sangre. Durante un daño o 20 lesión vascular, la exposición a la sangre del TF subendotelial y del colágeno conduce a la activación de los factores de la coagulación y las plaquetas y posteriormente a la formación de un tapón hemostático. La inducción inapropiada de la expresión del TF en una variedad de 25 escenarios clínicos puede conducir a una trombosis que amenace la vida y/o contribuir a complicaciones patológicas. Se cree que la exposición del TF después de la ruptura de la placa es responsable de una oclusión trombótica que conduce a un infarto de miocardio agudo y a 5 una apoplejía. En esos escenarios, las rutas de señalización proinflamatorias activadas por los factores de la coagulación también contribuyen a la formación de un edema e un tamaño aumentado del infarto. La lesión vascular asociada con una angioplastia conduce a la regulación en 10 sentido ascendente del TF sobre las SMC lo cual se cree que induce las rutas de señalización celular que están asociadas con una reestenosis. La sobreexpresión del TF en un cáncer y en una sepsis gram negativa conduce a una trombosis que amenaza a la vida y a una activación de las 15 rutas inflamatorias.

El complejo del factor VIIa (“FVIIa”)/TF está implicado en el mecanismo patógeno en una variedad de enfermedades trombóticas y el nivel de circulación del TF es un factor de riesgo para ciertos pacientes. El FVIIa y 20 el TF desempeñan unos cometidos únicos en su género en una lesión vascular manteniendo la hemóstasis e iniciando la trombosis. El TF es expresado en la adventicia normalmente, pero es regulado en sentido ascendente y expresado inapropiadamente en los medios y en la neoíntima en 25 enfermedades vasculares. La expresión del TF en placas ateroescleróticas es aumentada y protegida con respecto de la sangre por una tapa fibrosa delgada que puede romperse para exponer el TF. Las intervenciones quirúrgicas como la angioplastia con globo, el uso de dispositivos de stent, o 5 la endarterectomía dañan a la pared del bazo y exponen al TF subyacente. En la placa ateroesclerótica, de paredes delgadas, rica en lípidos, una ruptura espontánea o erosión endotelial conduce a una exposición del TF y a una trombosis, dando como resultado una angina inestable y un 10 infarto de miocardio. El TF puede circular en micropartículas derivadas de células y los niveles de TF en circulación son elevados en una angina inestable, sugiriendo que este TF en circulación puede contribuir a una formación de trombos (Soejima, H. y colaboradores 15 (1999) Circulation 99(22):2908-2913). Con frecuencia, un cáncer se asocia con un estado hipercoagulable atribuido a la sobreexpresión del TF en las células tumorales. Esto predispone al paciente a una trombosis venosa profunda, a un embolismo pulmonar y a una coagulación intravascular 20 diseminada de grado bajo (“DIC” acrónimo de disseminated intravascular coagulation). Una DIC da como resultado una deposición de fibrina microvascular que contribuye a una insuficiencia de órganos múltiples. Los resultados de unos modelos de lesión arterial aguda por trombosis indican que 25

La trombomodulina (“TM”) es una glicoproteína transmembranal que tiene propiedades anticoagulantes y es expresada predominantemente sobre la superficie luminar de 20 las células endoteliales que recubren a los vasos sanguíneos (Esmon, N.L. y colaboradores (1982) J. Biol. Chem. 257(2):859-864; Salem, H.H. y colaboradores (1983) J. Biol. Chem. 259(19):12246-12251). La TM de longitud completa, madura, es una proteína modular con 557 residuos 25 de aminoácidos que se compone de 5 dominios estructurales: una región hidrófoba, situada en el extremo terminal de N (residuos 1-226); una región rica en cisteína (residuos 226-462); una región rica en Ser/Thr glicosilada en O (residuos 463-497); una región transmembranal hidrófoba 5 (residuos 498-521); y una cola citoplasmática situada en el extremo terminal de C (residuos 522-557).

La región rica en cisteína incluye seis estructuras repetidas homólogas con un precursor de un factor de crecimiento epidérmico (“EGF”), llamadas dominios 10 similares a un EGF, con homología con un EGF o de un EGF. La región rica en cisteína puede ser dividida además en 3 dominios: las repeticiones 1, 2 y 3 similares a EGF (“EGF123”, residuos 226-344), el lazo entre dominios situado entre los EGF3 y EGF4 (residuos 345-349), y los 15 dominios 4, 5 y 6 similares a EGF (“EGF456”, residuos 350-462). La función del EGF456 es mediar en la fijación de trombina y en la activación de la proteína C. Un estudio ha sugerido que las quinta y sexta repeticiones similares a un EGF (“EGF5”, residuos 390-407, y “EGF6”, residuos 427-462, 20 respectivamente) tienen la capacidad de fijarse a la trombina (Kurosawa, S. y colaboradores (1988) J. Biol. Chem. 263 (13):5993-5996); otro sugiere que el dominio del EGF456 es suficiente para actuar como un cofactor para la actividad activadora de la proteína C mediada por trombina 25 (Zushi, M. y colaboradores (1989) J. Biol. Chem. 264(18):10351-10353). El dominio rico en Ser/Thr intensifica la fijación de la trombina mediada por EGF456, La tercera repetición similar a un EGF (“EGF”, residuos 311-344) es requerida para la activación de un agente 5 inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina (“TAFI” acrónimo de thrombin activatable fibrinolysis inhibitor). Se han descrito varios mutantes puntuales en el EGF3 que interfieren con la activación de un TAFI (Wang W. y colaboradores (2000) J. Biol. Chem.275(30):22942-22947). 10 Unos análogos a la TM que tienen la capacidad de intensificar la activación de la proteína C, mediada por trombina, pero que tienen una capacidad significativamente reducida de favorecer una activación de una TAFI, son útiles en una terapia antitrombótica (documento de 15 solicitud de patente internacional WO 01/98352). El complejo de trombina/TM convierte a la proteína C en una proteína C activada (“APC” acrónimo de activated protein C), que a su vez degrada a los factores Va y VIIa, impidiendo de esta manera una generación adicional de 20 trombina. Por lo tanto, la TM funciona como un conmutador molecular que convierte a la trombina desde un agente procoagulante a un agente anticoagulante.

La Km de la proteína C para el complejo de trombina/TM es reducida en un factor de 10 veces cuando la 25 TM está situada junto a una superficie de membrana (Esmon, C.T. (1995) FASEB J. 9(10):946-955). La concentración de la proteína C en sangre (0,065 µM) se encuentra significativamente por debajo de la Km informada (5µM) para el complejo de TM/trombina soluble, estableciendo por lo 5 tanto que la TM sobre la superficie de la membrana procoagulante dé como resultado una intensificación local notable de la velocidad de generación de la proteína C.

La TM inhibe a la trombosis por un mecanismo diferente al de la heparina o sus derivados. La heparina es 10 un cofactor para la antitrombina II e inhibe tanto al FXa como a la trombina a través de un mecanismo dependiente de la antitrombina III. La trombina fijada a un trombo es protegida contra la acción de la antitrombina III, lo cual limita la eficacia antitrombótica de la heparina o de una 15 heparina de bajo peso molecular (“LMWH” acrónimo de low molecular weight heparin) sobre coágulos preexistentes. Esto explica el fracaso de la heparina o de la LMWH en inhibir el crecimiento de trombos activado por la trombina o la protrombinasa fijada al coágulo en estudios con 20 primates no humanos. En contraste, una TM recombinante atenúa un coágulo inducido por la generación de trombina y la formación de fibrina de una manera dependiente de la dosis (Mohrl, M. y colaboradores (1998) Thromb. Haemost 80(6):925-929). El efecto agente inhibidor de la TM es 25 abolido por un anticuerpo...

 


Reivindicaciones:

1. Una proteína de fusión anticoagulante, que comprende una proteína directora hacia diana o un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de la misma, que se fija al factor tisular (TF) o al complejo de factor 5 VIIa/factor tisular (FVIIa/TF), que está ligado operativamente al dominio EGF456 de la trombomodulina (TM), o a un análogo, un fragmento, un derivado o una variante del mismo; fijándose la proteína de fusión anticoagulante al factor tisular (TF) o al complejo de factor VIIa/TF 10 (FVIIa/TF).

2. La proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el dominio de TM comprende el lazo entre dominios entre el EGF3 y el EGF4,

3. La proteína de fusión según las reivindicaciones 1 15 ó 2, en la que dicho dominio EGF456 contiene al menos una mutación puntual seleccionada del grupo que consiste en seleccionada del grupo que consiste en H381G, M388L, R456G y H457Q, que hace a dicha proteína de fusión más resistente a la lesión por oxidación o a la actividad de proteasas o 20 que aumenta la eficiencia catalítica de dicha proteína de fusión.

4. La proteína de fusión según la reivindicación 3, en la que dicho dominio EGF456 consiste en mutaciones puntuales en H381G, M388L, R456G y H457Q. 25

5. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína directora hacia diana es un anticuerpo que se fija a TF.

6. La proteína de fusión según la reivindicación 5, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 5

7. La proteína de fusión según la reivindicación 6, en la que dicho anticuerpo monoclonal se fija al complejo de FVIIa/TF con mayor afinidad que al TF solo.

8. La proteína de fusión según las reivindicaciones 6 o 7, en la que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo 10 de una sola cadena, un anticuerpo dímero de Fab o un anticuerpo de IgG.

9. La proteína de fusión según la reivindicación 8, en la que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de una sola cadena. 15

10. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 6 hasta 9, en la que dicho anticuerpo monoclonal está ligado operativamente a más de un dominio de TM.

11. La proteína de fusión según una cualquiera de las 20 reivindicaciones 6 hasta 10, en la que dicho anticuerpo monoclonal neutraliza al TF.

12. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicha proteína de fusión está glicosilada, está modificada por la adición de 25 un poli(etilen glicol) o está biotinilada para la fijación de estreptavidina.

13. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuya composición comprende un 5 excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha proteína de fusión.

14. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12 para su uso en proteger contra la formación de trombos. 10

15. La proteína de fusión según la reivindicación 14, en la que la protección contra la formación de trombos se relaciona con la apoplejía isquémica, con complicaciones trombóticas después de una angioplastia o con una cirugía microvascular. 15

16. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12 para su uso en prevenir y tratar la trombosis venosa profunda (DVT), la coagulación intravascular diseminada (DIC), el síndrome coronario agudo, o un cáncer con evidencia de coagulopatía en un 20 paciente.

17. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12 para su uso en regular la respuesta inflamatoria en un paciente, en la que la respuesta inflamatoria está seleccionada del grupo que 25 consiste en sepsis, injertos de piel y venas, y trasplantes de órganos.

18. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12 para su uso en formar un recubrimiento no trombógeno sobre la superficie de un 5 dispositivo médico.

19. Un estuche que comprende la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12.

20. Un estuche que comprende unas secuencias de ADN que codifican los componentes de la proteína de fusión 10 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12.

21. Una composición para terapia génica, que comprende el ADN que codifica la proteína de fusión que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3, en combinación con una cantidad terapéuticamente 15 efectiva de un vector de terapia génica.

22. La proteína de fusión según la reivindicación 9, en que dicha proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3.

20


 

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