Un procedimiento para renaturalización de Interleucina 4 o una muteína de interleucina 4 a concentraciones proteicas de 250 a 1000 [mg/l] que comprende añadir a una solución de proteínas desnaturalizadas,

químicamente modificadas o reducidas un tampón que contenga L-Cisteína y Tris-(hidroximetil)-aminometano/H2SO4 en una concentración de 1 a 3 mol/I o trietanolamina/H2 SO4 en una concentración de 0,5 a 2 moles/I

Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para la renaturalización de proteínas eucarióticas, recombinantes, que contienen enlaces disulfuro después de expresión en procariotas.

Antecedentes y técnica anterior

En el caso de la producción de proteínas recombinantes en sistemas de expresión heterólogos como por ejemplo Escherichia coli, estas proteínas a menudo forman agregados insolubles, inactivos (denominados "cuerpos retractiles" o "cuerpos de inclusión"). Adicionalmente, estos cuerpos de inclusión están contaminados por componentes de las células huésped como proteínas, ácidos nucleicos, endotoxinas y contaminantes de peso molecular bajo de las células huésped. Se asume que la formación de estos cuerpos de inclusión es un resultado de la concentración local muy alta de la proteína heteróloga en la célula durante la inducción y biosíntesis de proteínas. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína heteróloga en cuestión es también de gran importancia así como la presencia de residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro covalentes durante el replegamiento oxidativo. Antes de que estas proteínas objetivo se puedan usar, por ejemplo, para propósitos terapéuticos, los cuerpos de inclusión han de purificarse y, posteriormente, la estructura tridimensional tiene que estar renaturalizada para convertir la proteína a la conformación biológicamente activa.

Una secuencia comúnmente aplicada de etapas de procedimiento implica, primero, la solubilización de los cuerpos de inclusión mediante la adición de altas concentraciones de agentes desnaturalizantes caotrópicos (por ejemplo clorhidrato de guanidinio o urea), o mediante la adición de agentes fuertemente ácidos como, por ejemplo, mezclas de glicina/ácido fosfórico. De forma concurrente, los enlaces disulfuro intramoleculares presentes en los cuerpos de inclusión puede bien reducirse químicamente o bien escindirse mediante el así llamado procedimiento de sulfitolisis que involucra sulfito y un agente oxidante. En segundo lugar, la mezcla de proteína solubilizada puede purificarse adicionalmente bien por medios cromatográficos o bien por procedimientos de filtración, ambos de los cuales son procedimientos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica.

Subsiguientemente, la solución de proteína monomérica linealizada en presencia de altas concentraciones de agente caotrópico se dliluye altamente con el fin de tener en cuenta la formación de la forma biológicamente activa. Esto se puede llevar a cabo bien rápidamente (mediante dilución simple en un gran volumen de tampón de replegamiento) o bien lentamente por diafiItration o por diálisis frente al tampón de replegamiento. Otras técnicas descritas en la bibliografía implican la adsorción de la proteína objetivo en una resina cromatográfica y posteriormente, implican disminuir la concentración de agente caotrópico permitiendo que el replegamiento tenga lugar, o que tenga lugar cromatografía de exclusión por tamaño con el fin de separar las cadenas de la proteína eludiendo de este modo la tendencia a formar agregados. En cada caso, la concentración de la sal caotrópica tiene que disminuirse por debajo de un cierto límite, que es dependiente de la proteína objetivo, por ejemplo usualmente por debajo de clorhidrato de guanidinio 0,5 M.

D2 describe un procedimiento para la purificación de interleucina-4 humana expresada en E. coli que comprende la etapa de replegar la proteína desnaturalizada diluyendo su solución en un tampón de TRIS que comprende adicionalmente glutation.

La reacción secundaria principal durante el replegamiento es la formación de agregados insolubles, que es dependiente de la concentración local de intermedios de plegamiento. En la bibliografía, se describe un amplio intervalo de coadyuvantes de plegamiento, que suprimen de forma efectiva esta formación de agregados de proteínas insolubles, como por ejemplo proteínas chaperonas, otros tipos de proteínas (por ejemplo seroalbúmina bovina), y varios tipos de materiales no proteicos, incluyendo azúcares y azúcares cíclicos, alcoholes de cadena corta como por ejemplo glicerol, pentanol, hexanol, sustratos enzimáticos, polímeros sintéticos, detergentes y sales caotrópicas (de Bemárdez Clark, E (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 157-163 y citas en el mismo; Li Lie H, Schwarz E, Rudolph R (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9:947-501 y citas en el mismo; Sharma A, Karuppiah N (1998): patente de los Estados Unidos 5,728,804 presentada el 2 de junio de 1995). Aún otra aproximación se ha publicado recientemente donde los así llamados chaperones artificiales se usan para mantener intermedios de plegamiento hidrófobo en solución (Gellman S, Rozema DB (1996): patente de los Estados Unidos 5,563,057 presentada el 31 de octubre de 1994). En una primera etapa, los intermedios de plegamientos hidrófobos están atrapados en micelas detergentes conduciendo a una supresión de agregación de proteínas. Los intermedios de plegamiento atrapados no pueden a veces plegarse a la conformación nativa. En una segunda etapa, un "agente retirador", como por ejemplo diferentes ciclodextrinas o dextrinas lineales, se añaden en exceso molar considerable al eliminar el detergente dejando que la proteína se repliegue en su conformación biológicamente activa. Existen varias desventajas para este enfoque como 1. Gran exceso molar del caro "agente retirador", 2. Agregación proteica que tiene lugar durante la fase "retiradora", 3. Dificultad para eliminar detergente residual unido a la proteína diana, 4. Limitaciones en capacidad proteica y solubilidad de ciclodextrinas y 5. Sensibilidad del sistema de chaperonas artificial con respecto a variaciones en el procedimiento (solidez limitada). Además, los sistemas de chaperonas artificiales son específicos con respecto a la proteína objetivo, el tipo de detergente y el "agente retirador" y las condiciones experimentales empleadas. Por lo tanto, no hay sistema de chaperonas artificial genérico disponible (Daugherty DL, Rozema D, Hanson PE, Gellman SH (1998): J. Biol. Chem. 273: 33961-33971; Rozema D, Gellman SH (1996): J. Biol. Chem. 271: 3478-3487).

La mayoría de los supresores de agregación mencionados sólo trabajan con un número limitado de proteínas. Una ex cepción es el aminoácido L-arginina, que se muestra para ser generalmente aplicable a un amplio intervalo de proteínas diferentes como por ejemplo t-PA, fragmentos Fab, lisozima y otras enzimas (Rudolph R, Fischer S, Mattes R (1997): Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulfide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes. Patente de los Estados Unidos 5,593,865; Rudolph R, Fischer S, Mattes R (1995): Process for the activation of T-PA or ING after genetic expression in prokaryotes. Patente de los Estados Unidos 5,453,363; de Bernárdez Clark, E (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 157-163 y citas en éstas).

L-arginina estuvo mostrando ser efectiva para un número de proteínas sólo en alto exceso molar con respecto a la molaridad de la proteína a replegarse. El mecanismo por el que L-arginina suprime la formación de agregados de proteína aún es desconocido (Lilie H y col.(1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 497-501). Además, L-arginina es un producto químico bueno quiral, caro.

Así, existe todavía una necesidad de desarrollar estrategias para replegamiento de proteínas usando técnicas convencionales. A partir del estado de la técnica, no se conoce ningún supresor de agregación químicamente simple y barato generalmente utilizable, que se pueda aplicar en un procedimiento de replegamiento de proteínas comercialmente atractivo a concentraciones altas de hasta 0,5-1 g/l.

Sumario de la invención

Comenzando a partir de agregados de proteína insoluble (denominados cuerpos de inclusión) según se obtienen por sobreexpresión en Escherichia coli, es la tarea de la presente invención hacer disponible una vía comercialmente atractiva para la renaturalización de proteínas, es decir lnterleucina-4 y sus derivados, a altas concentraciones proteicas empleando un supresor de agregación adecuado, químicamente simple y fácilmente disponible.Debido a su inespecificidad, el/los supresor(es) de agregación como se describen en la presente invención se pueden aplicar a un amplio intervalo de proteínas diferentes.

El procedimiento descrito en el presente documento comprende añadir una solución de proteínas desnaturalizadas, modificadas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para renaturalización de Interleucina 4 o una muteína de interleucina 4 a concentraciones proteicas de 250 a 1000 [mg/l] que comprende añadir a una solución de proteínas desnaturalizadas, químicamente modificadas o reducidas un tampón que contenga L-Cisteína y Tris-(hidroximetil)-aminometano/H2SO4 en una concentración de 1 a 3 mol/I o trietanolamina/H2 SO4 en una concentración de 0,5 a 2 moles/I.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el tampón contiene adicionalmente un potenciador de solubilidad.

3. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que el potenciador de solubilidad es un ion.

4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que el potenciador de solubilidad es cloruro.