MÉTODO PARA DETERMINAR LA GENOTOXICIDAD.

Un método in-vitro para determinar la genotoxicidad de un compuesto prueba,

dicho método comprende: (a) contactar una célula de prueba viable con dicho compuesto prueba; (b) determinar el cambio en el nivel de expresión de un gen indicador en el que dicho gen indicador es 4833427G06 Rik (cDNA RIKEN); en el que un aumento en la expresión de al menos 1,5 veces, indica que dicho compuesto prueba presenta genotoxicidad

La presente invención está relacionada con las áreas de la molecular biología y la toxicología. Más específica-mente, la presente invención está relacionada con los métodos para determinar la genotoxicidad de los compuestos y células de ensayo, animales transgénicos no humanos, equipos y reactivos de los mismos.

La respuesta celular de los mamíferos al daño geno-tóxico se analiza a menudo utilizando una batería de pruebas, que suelen incluir pruebas de aberraciones cromosómicas in vitro o de formación de micronúcleos. Ambas pruebas visualizan el daño en el DNA en las células tras la exposición a agentes potencialmente genotóxicos al analizar aberraciones en los cromosomas recogidos (S.M. Galloway, Environ Mol Mutagen (2000) 35:191-201) o al examinar los micronúcleos formados en las células cuyo DNA se ha dañado (W. von der Hude et al., Mutation Res (2000) 468:137-63). Sin embargo, existen problemas significativos con la interpretación de los resultados de las pruebas de genotoxicidad in vitro utilizadas actualmente. Los resultados falsos positivos no son extraños en estas pruebas y el subsiguiente análisis, que involucra pruebas en animales in vivo, pueden ser costosos tanto económicamente como en su duración. Son necesarios ensayos que mejor pueden predecir el potencial genotóxico de un compuesto (véase, por ejemplo, R.K. Newton

et al., Environ Health Persp (2004) 112:420-22). En respuesta al estrés genotóxico, las células en división que se someten a una diferenciación celular se detienen en etapas concretas del ciclo celular (véase, por ejemplo, T. Weinert et al., Nature Gen (1999) 21:151-52; T. Weinert, Cell (1998) 94: 555-58). Se cree que esta parada para la diferenciación resulta de la activación de quinasas reguladoras clave y otros componentes de respuesta al daño en el DNA en los puntos de control críticos del ciclo celular (T. Weinert (1998) supra; B.S. Zhou-Bin et al., Nature Rev Cancer (2004) 4:216-25).

P.L. Puri et al., Nature Gen (2002) 32:585-93 investigó la capacidad de cuatro agentes genotóxicos conocidos (sulfonato de metilmetano, cisplatino, etoposido, y radiación ionizante) de inhibir la diferenciación de células mioblastos C2C12 en miotubos. Los efectos de los agentes también se examinaron analizando la expresión de las proteínas específicas de músculo (miogenina, cadena pesada de la miosina, MyoD), y utilizando un gen marcador de la luciferasa acoplado al promotor de la quinasa de la creatinina muscular.

El gen DDA3 murino se secuenció para su estudio debido a su regulación por p53 (P-K. Lo et al., Oncogene (1999) 18:7765-74). P-K Lo et al. también descubrieron que DDA3 estaba regulado positivamente en las células NIH3T3 expuestas a agentes que causan daño en el DNA como la adriamicina y la mitomicina C. P-K Lo et al. descubrieron que DDA3 estaba altamente expresado en cerebro, bazo y pulmón (con

una expresión moderada en riñón), no se encontró expresión

o tenía una expresión mínima en corazón, hígado, músculo esquelético o testículos. La secuencia de genómico en 5' (incluyendo la región reguladora corriente arriba) ha sido secuenciada y descrita por S. C. Hsieh et al., Oncogene (2002) 21:3050-57, que identificaron el elemento de unión a p53 y determinaron que su expresión también estaba inducida por p73. P. K. Lo & F. F. Wang, Biochim Biophys Acta (2002) 1579:214-18 publicaron la identificación y la secuenciación de un homólogo de DDA3 humano, y también encontraron que se expresa en casi cada tejido excepto en músculo esquelético de adulto. P. K. Lo & F. F. Wang, Arch Biochem Biophys (2004) 425:221-32 publicaron que el DDA3 murino se transcribe o edita en una serie de formas diferentes. Sohn et al., Carcinogenesis, volumen 23, número 6, págs. 949 - 957, describe como gen indicador las secuencias reguladoras del gen supresor de tumores p53. Este gen se utiliza como gen marcador en las células cancerosas humanas transfectadas. A continuación se prueban una batería de agentes quimioterapéuticos y potencialmente genotóxicos in vitro. De los agentes quimioterapéuticos/ genotóxicos probados, la mayoría inducen la construcción marcadora de p53 en al menos un factor de 2.

Tugendreich et al., WO 2004/037200, describen la medida de las respuestas genómicas de las células de hígado de rata a la hidroxiurea, citarabina, doxorubicina, ifosfamida, tioguanina, azatioprina, etoposido y albendazol, todos ellos administrados in vivo. Las respuestas genómicas se

utilizaron entonces para generar una "firma de respuesta al fármaco" que correlaciona la regulación transcripcional de dos genes (aminolevulinato sintasa 2 delta, Genbank NM 013197; y periferina 1, Genbank NM 012633) con la tendencia de cada compuesto a causar la depleción de reticulocitos.

Se ha determinado que varios genes se activan en las células eucariotas capaces de una posterior diferenciación cuando dichas células se exponen a agentes que dañan el DNA (genotóxicos) tras la inducción de la diferenciación.

Un aspecto de la invención comprende un método para determinar la genotoxicidad de un compuesto prueba, al poner en contacto una célula capaz de diferenciarse con el compuesto prueba, inducir la diferenciación, y determinar el nivel de expresión de uno o más genes indicadores. Por lo tanto, la presente solicitud proporciona un método para determinar la genotoxicidad de un compuesto prueba, dicho método comprende:

(a) poner en contacto una célula de prueba viable con dicho compuesto prueba;

(b) determinar el cambio en el nivel de expresión de un gen indicador en el que dicho gen indicador se selecciona de entre el grupo que consiste en Prelp (Repetición rica en leucina con extremo rico en prolina-arginina); Sesn2 (Sestrina 2); 4833427G06 Rik (cDNA RIKEN); Dda3 (Presentación diferencial activado por p53); Usp30 (Proteasa 30 específica de Ubiquitina); 0610013D04 Rik (cDNA RIKEN); Slc19a2 (familia 19 de transportadores de solutos (trans

portador de tiamina), miembro 2); Trp53inp1 (Proteína relacionada con la transformación 53, proteína nuclear inducible 1); D4Ertd421e (segmento de DNA, Chr 4, ERATO Doi 421, expressado); Shcbp1 (dominio Shc 1 de unión a proteína SH2); Mki67 (antígeno identificado mediante el MAb Ki67); Phex (endopeptidasa neutral reguladora de fosfato (cromosoma X)); Tk1 (quinasa de timidina 1); Mmhead (clon de cDNA de cabeza de embrión de 15 días Mus musculus); Osbpl6 (proteína 6 similar a la proteína de unión a oxisterol); Mphosph1 (fosfoproteína de fase M); Ephx1 (hidrolasa de epóxido 1 (hidrolasa xenobiótica microsomal); Top2a (Topoisomerasa (DNA) II alfa); Ccng1 (Ciclina G1); Plf (Proliferina); Np95 (proteína nuclear 95); Rad51ap1 (proteína 1 asociada a RAD51); Nos3 (sintasa 3 de óxido nítrico, célula endotelial); 2610005B21 Rik (cDNA RIKEN); Brca1 (Cáncer de mama 1); Stk18 (quinasa de serina/treonina 18); Calmbp1 (proteína de unión a calmodulina 1); Lek1 (proteína 1 de la familia de leucina, ácido glutámico, lisina); Smc211 (proteína 1 similar a SMC2 de mantenimiento estructural de cromosomas 2); E2f7 (factor transcripción E2F 7); Hmmr (receptor de motilidad mediado por hialuronano (RHAMM)); Nusap1 (proteína 1 nucleolar y asociada al huso); Fbxo5 (proteína 31 de f-box); Slc19a2 (familia 19 transportadora de solutos (transportador de tiamina), miembro 2); 9030617003 Rik (cDNA RIKEN); Ly6e (complejo del antígeno 6 de linfocitos, locus E); 6530401L14 Rik (cDNA RIKEN); Mad3 (proteína de dimerización Max 3); Hmgb2 (caja del grupo de alta movilidad 2); Kif11 (Quinesina 11); Mad211 (proteína 1 similar a

MAD2 (deficiente en parada mitótica, homólogo) (levadura)); Asf1b (función anti-silenciadora de ASF1 1 homólogo B (Saccharomyces)); Mcm3 (deficiente en el mantenimiento de minicromosomas 3 (Saccharomyces)); MGC: 32192 (clon de cDNA MGC:32192 IMAGE:5006129 de Mus musculus); Foxm1 (caja forkhead M1); Anxa8 (Anexina A8); S1c35a5 (familia 35 de transportadores de solutos, miembro A5); E030024M05 Rik (cDNA RIKEN); Cks2 (subunidad 2 reguladora de la proteína quinasa CDC28); Cilp (proteína de la capa intermedia de cartílago); Tacc3 (proteína 3 que contiene sobreenrrollamiento, acídica, transformante); Prc1 (Proteína reguladora de citoquinas 1); 2610509G12 Rik (cDNA RIKEN); 2810417H13 Rik (cDNA RIKEN); Pbk (quinasa de unión a PDZ); Capn6 (calpaína 6); Gmnn (geminina); Mcmd4 (deficiente en el mantenimiento de minicromosomas 4 homólogo); Ccna2 (ciclina A2); Pola1 (polimerasa de DNA alfa 1, 180 kDa); Hmgb3 (caja del grupo de alta movilidad 3); Tagln (Transgelina (proteína 22 del músculo liso)); 1600013K19 Rik (cDNA RIKEN);...

1. Un método in-vitro para determinar la genotoxicidad de un compuesto prueba, dicho método comprende:

(a) contactar una célula de prueba viable con dicho compuesto prueba;

(b) determinar el cambio en el nivel de expresión de un gen indicador en el que dicho gen indicador es 4833427G06 Rik (cDNA RIKEN); en el que un aumento en la expresión de al menos 1,5 veces, indica que dicho compuesto prueba presenta genotoxicidad.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho gen indicador es 4833427G06Rik y Dda3.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha célula de prueba comprende una célula mioblástica.

4. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha célula de prueba se selecciona de células blásticas de ratón, rata, pez cebra, humano, chimpancé, y pollo.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que determinar el cambio en el nivel de expresión comprende medir la cantidad de mRNA producido utilizando RT-PCR.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que determinar el cambio en el nivel de expresión comprende medir el aumento en la señal producida por el aumento de expresión de un marcaje.