PROTEINAS FLUORESCENTES Y CROMOPROTEÍNAS DE ESPECIES DE HIDROZOOS QUE NO SON AEQUOREA Y MÉTODOS PARA SU USO.

Molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente o una cromoproteína,

seleccionada del grupo que consta de: (a) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22; (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida mostrada en los números de secuencia: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21; (c) un ácido nucleico que se hibrida, bajo condiciones severas, al ácido nucleico de (a) o (b) , descrito anteriormente; (d) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácido de (a) , descrita anteriormente; (e) un ácido nucleico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia nucleótida de (b) , descrita anteriormente; (f) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una sustitución, supresión o inserción de al menos un aminoácidoen la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22; (g) un derivado o mimético del ácido nucleico de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f) , descrito anteriormente; (h) un mutante del ácido nucleico de (a) , (b) , (c) , (d) o (e) , descrito anteriormente; (i) un ácido nucleico diferente del ácido nucleico de (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) , descrito anteriormente, debido a la degeneración del código genético; y (j) un fragmento del ácido nucleico de (a) o (b) , descrito anteriormente

Campo de la invención

La invención se refiere en general al campo de la biología y la química. Más en particular la invención se dirige a proteínas fluorescentes.

Antecedentes de la invención

El marcaje de una proteína, célula u organismo de interés tiene una función destacada en muchas aplicaciones bioquímicas, de biología molecular y de diagnóstico médico. Se ha desarrollado y usado en la técnica una variedad de marcadores diferentes, incluyendo radiomarcadores, cromomarcadores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, y similares, con diferentes propiedades y usos óptimos. Sin embargo, existe un interés continuo en el desarrollo de nuevos marcadores. Tiene un interés particular el desarrollo de nuevos marcadores proteínicos, incluyendo marcadores proteínicos fluorescentes.

La proteína fluorescente verde (GFP), sus mutantes y homólogos son ampliamente conocidos hoy en día debido a su uso intensivo como marcadores fluorescentes in vivo en ciencias biomédicas, discutido en detalle por Lippincott-Schwartz y Patterson en Science (2003) 300 (5616):87-91). La GFP de la hidromedusa Aequorea aequorea (sinónimo A. victoria), descubierta por Johnson y col. en J. Cell Comp. Physiol. (1962), 60:85-104, se encontró como parte del sistema bioluminiscente de la medusa, en la que la GFP tenía una función de emisor secundario transformando la luz azul de la fotoproteína aecuorina en luz verde. Después, se aislaron proteínas similares de varios celentéreos bioluminiscentes incluyendo la medusa hidroide Phialidium gregarium, pensamiento de mar Renilla (clase Anthozoa) y otros (véase Ward y col. en Photochem. Photobiol. (1982), 35: 803-808; Levine y col. en Comp. Biochem. Physiol. (1982), 72B: 77-85; Chalfie en Photochem. Photobiol. (1995), 62:651-656). Todas estas proteínas presentan fluorescencia verde (emisión a 497-509 nm) y funcionan como emisores secundarios en bioluminiscencia. Las proteínas fluorescentes también se aislaron de la especia Physalia y se determinó su secuencia de aminoácidos N-terminal (documento WO 03/017937).

El ADNc que codifica la GFP de A. victoria fue clonado por Prasher y col. (Gene (1992), 111(2):229- 33). Resultó que este gen puede ser expresado de forma heteróloga prácticamente en cualquier organismo, debido a la capacidad única de la GFP de formar un fluoróforo por si misma (Chalfie y col., Gene (1992), 111 (2):229-233). Este descubrimiento abre perspectivas amplias para usar la GFP en biología celular como un marcador fluorescente genéticamente codificado.

La GFP se aplicó en una amplia variedad de aplicaciones incluyendo el estudio de la expresión de genes y localización de proteínas (Chalfie y col., Science 263 (1994), 802-805, y Heim y col. en Proc. Nat. Acad. Sci. (1994),

91: 12501-12504), como herramienta para visualizar orgánulos subcelulares en células (Rizzuto y col., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), para visualizar el transporte de proteínas a lo largo de la ruta secundaria (Kaether y Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).

Se ha llevado a cabo una gran cantidad de investigación para mejorar las propiedades de la GFP y producir reactivos de GFP útiles y optimizados para una variedad de propósitos de investigación. Se han desarrollado nuevas versiones de la GFP, tales como ADN de GFP “humanizado”, cuyo producto proteína tiene una síntesis mayor en células de mamífero (Haas, y col., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, y col., Nucleic Acids Research (1996),

24: 4592-4593). Una de dichas proteínas humanizadas es la “proteína fluorescente verde potenciada” (EGFP). Otras mutaciones de la GFP han producido versiones que emiten luz azul, cian y verde-amarilla. Sin embargo, debido a la gran utilidad de la GFP, serían útiles en la técnica otras proteínas fluorescentes con propiedades similares o diferentes de la GFP. En particular, los beneficios de nuevas proteínas fluorescentes incluyen posibilidades de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) basada en nuevos espectros y mejor idoneidad para una excitación más extensa. En 1999 se clonaron homólogos de la GFP de especies de Anthozoa no bioluminiscentes (Matz y col., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Este descubrimiento demostró que estas proteínas no son un componente necesario de la maquinaria bioluminiscente. Las proteínas similares a GFP derivadas de Anthozoa presentaban una gran diversidad espectral incluyendo proteínas fluorescentes cian, verde, amarillo, rojo y cromoproteínas (CP) no fluorescentes azul-púrpura (Matz y col., Bioessays (2002), 24(10):953- 959).

El mayor inconveniente de las proteínas similares a la GFP derivadas de Anthozoa es la fuerte oligomerización que dificulta el uso de estas proteínas en muchas aplicaciones (Lauf y col., FEBS Lett. (2001), 498: 11-15; Campbell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002), 99: 7877-7882; Mizuno y col., Biochemistry (2001), 40: 2502-2510). Por consiguiente, un objeto es proporcionar nuevas proteínas fluorescentes monómeras de diferentes colores así como los ADN que las codifican, que no tengan los inconvenientes de la GFP conocida.

Las especies de hidrozoos son una fuente potencial de dichas proteínas. Excepto la GFP de Aequorea victoria y homólogos de la GFP de otras especies de Aequorea, como los homólogos de la GFP muy próximos de Aequorea macrodactyla (número de acceso en GenBank AF435427-AF435433) y Aequorea coerulescens (Gurskaya y col., Biochem J. (2003), 373(Pt 2): 403-408), hasta la fecha no se han clonado otros genes que codifiquen proteínas fluorescentes de hidrozoos, aunque algunas de ellas se han caracterizado a nivel de proteína desde hace tiempo. La clonación y mutagénesis de proteínas fluorescentes de hidrozoos que no son Aequorea, es una forma posible de obtener nuevos marcadores fluorescentes con características mejoradas.

Otras técnicas anteriores importantes incluyen la de PRASHER D.C.: "Using GFP to see the light" Trends In Genetics, Elsevier, Amsterdam, NL, vol. 11, no. 8, 1995, páginas 320-323, XP004207387 ISSN: 0168-9525.

Resumen de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína fluorescente, seleccionada del grupo que consiste en:

(a) un ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; y

(b) un ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Dicho ácido nucleico se puede aislar, sintetizar o estar presente en un medio no natural.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la presente invención se aísla de especies de hidrozoos que no son Aequorea que incluyen Phialidium sp., y dos medusas fluorescentes o medusas hidroides 1 y 2 (hidromedusas 1 y 2) del suborden Anthomedusae, o mutantes o derivados de las mismas.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una proteína fluorescente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 93% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Preferiblemente, la proteína fluorescente que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 tiene un máximo de excitación a 525 nm y un máximo de emisión a 537 nm.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, un casete de expresión que comprende:

(a) la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; y

(b) elementos reguladores para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la célula huésped deseada.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, una célula que comprende la molécula de ácido nucleico, el vector o el casete de expresión de acuerdo con la presente invención, en la que la célula no es una célula madre embrionaria humana.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, una línea celular estable que comprende la molécula de ácido nucleico, el vector o el casete de expresión...

1. Molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente o una cromoproteína, seleccionada del grupo que consta de:

(a) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida mostrada en los números de secuencia: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21;

(c) un ácido nucleico que se hibrida, bajo condiciones severas, al ácido nucleico de (a) o (b), descrito anteriormente;

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácido de (a), descrita anteriormente;

(e) un ácido nucleico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia nucleótida de (b), descrita anteriormente;

(f) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una sustitución, supresión o inserción de al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22;

(g) un derivado o mimético del ácido nucleico de (a), (b), (c), (d), (e) o (f), descrito anteriormente;

(h) un mutante del ácido nucleico de (a), (b), (c), (d) o (e), descrito anteriormente;

(i) un ácido nucleico diferente del ácido nucleico de (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h), descrito anteriormente, debido a la degeneración del código genético; y

(j) un fragmento del ácido nucleico de (a) o (b), descrito anteriormente.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico está aislado de un organismo de la clase Hydrozoa.

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico está aislado de un organismo del suborden Anthomedusae.

4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico está aislado del género Phialidium.

5. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.

6. Casete de expresión que comprende (a) la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1; y (b) elementos de regulación para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la célula huésped deseada.

7. Célula que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5 o el casete de expresión según la reivindicación 6.

8. Línea celular estable que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5 o el casete de expresión según la reivindicación 6.

9. Planta transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5 o el casete de expresión según la reivindicación 6.

10. Animal transgénico que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5 o el casete de expresión según la reivindicación 6.

11. Método de producción de una proteína fluorescente o de una cromoproteína, comprendiendo dicho método los pasos de (a) aportar una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 unida operativamente a unos elementos adecuados de regulación de la expresión, (b) expresar la proteína fluorescente o la cromoproteína de dicha molécula de ácido nucleico, y (c) aislar la proteína de manera que quede sustancialmente libre de otras proteínas.

12. Molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, codificando dicho fragmento un péptido de una longitud de al menos 100 aminoácidos.

13. Molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia muy parecida o idéntica a una secuencia nucleótida de una longitud de al menos 300 residuos de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.

14. Proteína fluorescente o cromoproteína aislada seleccionada del grupo que consta de:

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22;

(b) una proteína codificada por la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida mostrada en los números de secuencia: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21;

(c) una proteína que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácido de (a) o (b), descrita anteriormente;

(d) un mutante de la proteína de (a), (b) o (c), descrita anteriormente;

(e) una proteína que tiene una sustitución, supresión o inserción de al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22;

(f) un derivado de la proteína de (a), (b), (c), (d) o (e), descrito anteriormente;

(g) un fragmento de la proteína de (a), (b), (c), (d), (e) o (f), descrito anteriormente; y

(h) una proteína que tiene una secuencia muy parecida o idéntica a una secuencia de aminoácido de una longitud de al menos 100 residuos de (a) o (b), descrita anteriormente.

15. Proteína de fusión que comprende la proteína según la reivindicación 14.

16. Anticuerpo que se une específicamente a la proteína según la reivindicación 14.

17. Conjunto que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5, el casete de expresión según la reivindicación 6, la proteína según la reivindicación 14, la proteína de fusión según la reivindicación 15 o medios para producirla.

18. Sonda o cebador oligonucleótido que comprende la secuencia nucleótida capaz de hibridarse a la secuencia nucleótida seleccionada del grupo consistente en los números de secuencia: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21.

19. Método de etiquetado de una molécula biológica, que comprende el paso de acoplar dicha molécula biológica a la proteína según la reivindicación 14.

20. Método de etiquetado de una célula que comprende el paso de producir la proteína según la reivindicación 14 en la célula.

21. Método de etiquetado de un organelo celular que comprende el paso de producir la proteína según la reivindicación 14 fundida con la señal de localización subcelular adecuada en la célula.

22. Método de análisis de una molécula biológica, una célula o un organelo celular, que comprende el paso de detectar la señal de fluorescencia de la proteína según la reivindicación 14 ó 15.

23. Método de análisis de una molécula biológica, una célula o un organelo celular, que comprende el paso de expresar la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 en una célula.

24. Método de detección de una molécula biológica que comprende el paso de detectar la señal de fluorescencia de la proteína según la reivindicación 14 ó 15.