SECUENCIAS DE ADN QUE TIENEN ACTIVIDAD ANTI-REPRESORA.

Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora,

seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en: (a) el SEQ ID: 9 de la Figura 20; (b) un fragmento del SEQ ID: 9 de la Figura 20; (c) una secuencia derivada del SEQ ID: 9 de la Figura 20 por inserción, deleción y/o mutación de una o más bases; donde la actividad anti-represora de dicha secuencia confiere a una célula de osteosarcoma U-2 OS humana la capacidad para crecer después de 4-5 semanas de cultivo en presencia de 250 µg/ml de Zeocina y 0,1 ng/ml de doxiciclina, cuando dicha célula comprende una proteína de fusión represora de LexA que contiene el dominio de unión a ADN de LexA y una región codificadora de HP1 o HPC2 bajo el control del sistema regulador de la transcripción Tet-Off, cuando dicha secuencia de ADN aislada y/o recombinante es clonada en una secuencia poliligadora en un plásmido, estando situado dicho poliligador entre cuatro sitios operadores de LexA y el promotor de SV40 que controla el gen de resistencia a zeocina, cuando el plásmido está presente en dicha célula

La invención hace referencia a los campos de la medicina y la biología celular. La invención en particular hace referencia a los medios y métodos para la regulación de la transcripción génica. Adicionalmente la invención hace referencia a los medios y métodos para determinar si una secuencia de ADN comprende una cualidad moduladora de la transcripción génica y/o una cualidad represora de la transcripción génica.

Con el progreso de los diversos proyectos genoma, se han vuelto asequibles las secuencias de los genomas completos de los organismos. La avalancha de datos ha incrementado el interés de muchos investigadores. Uno de los descubrimientos más notables fue la observación de que el genoma humano no codifica significativamente más genes que el genoma de organismos simples como la mosca de la fruta. El enfoque de muchos investigadores se está desplazando ahora de la identificación de los genes a la determinación de la expresión génica y la función génica. Los ejemplos de tales tecnologías son las micromatrices de ADN, las aplicaciones genómicas funcionales y la proteinómica. Estas tecnologías tienen en común que están centradas en la función y expresión de secuencias codificadoras. No obstante, si bien nuestro conocimiento de los genes aumenta espectacularmente, la comprensión de cómo está regulada la expresión de los genes está limitando la capacidad de aplicar este conocimiento rápidamente creciente. Este es por ejemplo el caso en la generación de plantas y animales transgénicos y en la terapia génica humana. En estas aplicaciones el ácido nucleico foráneo es introducido típicamente en células para obtener la expresión de las secuencias codificadoras. A menudo la integración del ácido nucleico foráneo en el genoma de la célula es requerida para el funcionamiento prolongado de las secuencias introducidas. No obstante, la integración de secuencias en el genoma conduce a la imprevisibilidad de la expresión debido a que el ADN circundante influye en la transcripción de las secuencias integradas. Esta imprevisibilidad es debida en parte al hecho de que las secuencias introducidas no pueden ser proporcionadas todavía con la suficiente información genética para aislar funcionalmente las secuencias integradas de los efectos que influyen en la transcripción del ADN circundante. Por otra parte esto es debido al hecho de que no se sabe suficiente sobre los efectos que influyen en la transcripción del ADN circundante.

La presente invención tiene que ver con las secuencias de ADN que comprenden la capacidad de influir en la transcripción de los genes en cis. Típicamente, aunque no necesariamente, las secuencias investigadas no codifican por sí mismas una proteína funcional. Diversas secuencias de elementos de secuencia no codifican por sí mismas una proteína funcional. Se han identificado diversos elementos de secuencia con la capacidad de afectar a la transcripción génica en cis. Estos elementos se extienden desde promotores, intensificadores, y silenciadores de elementos limítrofes y regiones de anclaje a la matriz.

El hecho de que se hayan descubierto tantos tipos diferentes de secuencias reguladoras da la impresión de que es muy fácil diseñar casetes de expresión eficaces. No obstante, más bien es al contrario. El diseño de casetes de expresión todavía está dirigido a menudo por el ensayo y error. Bastante a menudo es posible obtener alguna clase de expresión de un gen foráneo en una célula diana o en su progenie. No obstante, muy a menudo es difícil prever con cualquier clase de exactitud el nivel de expresión o la persistencia de la expresión que una casete de expresión puede presentar en una célula diana.

Un método para detectar, y opcionalmente seleccionar, una secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica, comprende proporcionar un sistema de transcripción con una variedad de vectores que comprenden fragmentos, comprendiendo dichos vectores i) un elemento con una cualidad represora de la transcripción génica, y ii) un promotor que dirija la transcripción de un gen informador, comprendiendo el método adicionalmente realizar una etapa de selección en dicho sistema de transcripción con el fin de identificar dicha secuencia de ADN con dicha cualidad moduladora de la transcripción génica. Dichos fragmentos pueden estar localizados entre i) dicho elemento con una cualidad represora de la transcripción génica, y ii) dicho promotor que dirige la transcripción de dicho gen informador. La ARN polimerasa inicia el proceso de transcripción tras la unión a una secuencia específica, denominada promotor, que señala dónde debe comenzar la síntesis de ARN. Una cualidad moduladora puede intensificar la transcripción a partir de dicho promotor en cis, en un tipo de célula dado y/o un promotor dado. La misma secuencia de ADN puede comprender una cualidad intensificadora en un tipo de célula o con un tipo de promotor, mientras puede comprender o no otra cualidad moduladora de la transcripción génica en otro tipo de célula o con otro tipo de promotor. La transcripción puede estar influenciada por un efecto directo del elemento regulador (o la proteína o las proteínas que se unen a él) sobre la transcripción de un promotor concreto. No obstante, la trascripción puede estar influenciada por un efecto indirecto, por ejemplo porque el elemento regulador afecta a la función de uno o más elementos reguladores distintos. La cualidad moduladora de la transcripción génica también puede comprender una cualidad de la transcripción génica estable. Con estable se quiere significar que el nivel de transcripción observado no cambia significativamente a lo largo de al menos 30 divisiones celulares. Una cualidad estable es útil en situaciones en las que las características de expresión deben ser predecibles a lo largo de muchas divisiones celulares. Los ejemplos típicos son las líneas cellares transfectadas con genes foráneos. Otros ejemplos son los animales y plantas transgénicos y las terapias génicas. Muy a menudo, las casetes de expresión introducidas funcionan de manera diferente al cabo de un número creciente de divisiones celulares o generaciones de plantas o animales. En una realización preferida una cualidad estable comprende la capacidad de mantener la transcripción génica en generaciones posteriores de una planta o animal transgénico. Por supuesto en el caso de que la expresión sea inducible, dicha cualidad comprende la cualidad de mantener la inducibilidad de la expresión en generaciones posteriores de una planta o animal transgénico. Frecuentemente, los niveles de expresión caen espectacularmente con el número creciente de divisiones celulares. Con un método descrito en el presente documento es posible detectar y opcionalmente seleccionar una secuencia de ADN que sea capaz de prevenir al menos en parte la espectacular caída en los niveles de transcripción con números crecientes de divisiones celulares. Dicha cualidad moduladora de la transcripción génica puede comprender una cualidad de transcripción génica estable. Sorprendentemente, los fragmentos que comprenden una secuencia de ADN con dicha cualidad de transcripción génica estable pueden ser detectados y opcionalmente seleccionados con un método descrito en el presente documento, a pesar del hecho de que dicho método no mide necesariamente la estabilidad a largo plazo de la transcripción. En una realización preferida de la invención dicha cualidad moduladora de la transcripción comprende una cualidad intensificadora de la transcripción génica estable. Se ha observado que la incorporación de una secuencia de ADN a un vector de expresión con un gen de interés, produce un nivel superior de transcripción de dicho gen de interés, tras la integración del vector de expresión al genoma de una célula y por otra parte que dicha expresión génica superior también es más estable que en ausencia de dicha secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica.

En experimentos diseñados para introducir un gen de interés en el genoma de una célula y para obtener la expresión de dicho gen de interés, se ha observado lo siguiente. Si junto con dicho gen de interés también se había introducido una secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica, se podían detectar más clones que expresaban más de una cierta cantidad de producto génico de dicho gen de interés, que cuando dicha secuencia no era introducida junto con dicho gen de interés. De este modo la presente invención también proporciona un método para incrementar el número de células que expresan más de cierto nivel de un producto génico de un gen de interés tras proporcionar dicho gen de interés...

1. Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora, seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en:

inserción, deleción y/o mutación de una o más bases;

donde la actividad anti-represora de dicha secuencia confiere a una célula de osteosarcoma U-2 OS humana la capacidad para crecer después de 4-5 semanas de cultivo en presencia de 250 µg/ml de Zeocina y 0,1 ng/ml de doxiciclina, cuando dicha célula comprende una proteína de fusión represora de LexA que contiene el dominio de unión a ADN de LexA y una región codificadora de HP1 o HPC2 bajo el control del sistema regulador de la transcripción Tet-Off, cuando dicha secuencia de ADN aislada y/o recombinante es clonada en una secuencia poliligadora en un plásmido, estando situado dicho poliligador entre cuatro sitios operadores de LexA y el promotor de SV40 que controla el gen de resistencia a zeocina, cuando el plásmido está presente en dicha célula.

2. Un constructo de ADN recombinante provisto de una secuencia de ADN según la reivindicación 1.

3. Un constructo de ADN según la reivindicación 2, que comprende adicionalmente un promotor conectado operablemente a una secuencia de ácido nucleico de interés.

4. Un constructo de ADN según la reivindicación 3, donde dicha secuencia de ácido nucleico de interés es un marco de lectura abierto de un transgen.

5. Un constructo de ADN según la reivindicación 4, donde dicho promotor es un promotor exógeno.

6. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 35, donde dicho promotor es un promotor constitutivo fuerte, preferiblemente un promotor viral, o un promotor inducible.

7. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 36, donde dicho promotor es un promotor de CMV, un promotor de SV40 o un promotor Tet-Off.

8. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 37, que comprende en el siguiente orden:

(i) una secuencia de ADN según la reivindicación 1,

(ii) el promotor conectado operablemente a la secuencia de ácido nucleico de interés, y

(iii) una secuencia de ADN según la reivindicación 1, preferiblemente en orientación opuesta a (i).

9. Un método para obtener una célula anfitriona que comprende la etapa de transfectar la célula anfitriona con un constructo de ADN A según una cualquiera de las reivindicaciones 3-8.

10. Una célula que comprende un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 3-8.

11. Una célula según la reivindicación 10, que comprende múltiples copias de dicho constructo de ADN.

12. Una célula según la reivindicación 10 u 11, que es una célula CHO.

13. Un método para producir un producto génico en una célula que comprende proporcionar una casete de expresión que comprende:

(i) un transgen que codifica dicho producto génico,

y

(ii) una secuencia de ADN según la reivindicación 1,

y permitir la transcripción de dicha casete de expresión en una célula.

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14. Un método según la reivindicación 13, donde dicha célula es una célula CHO.

15. Un método según la reivindicación 13 o 14, donde la casete de 10expresión comprende en el siguiente orden:

(i) una secuencia de ADN según la reivindicación 1,

(ii) el transgen que comprende un promotor conectado

operablemente a un marco de lectura abierto que codifica dicho 15producto génico, y

(iii) una secuencia de ADN según la reivindicación 1, preferiblemente en orientación opuesta a (i).

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13-15,

20 donde se proporciona una multiplicidad de dichas casetes de expresión y se permite la transcripción de las mismas en dicha célula, y la expresión de dicho transgen depende del número de copias.

17. El uso in vitro de una secuencia de ADN según la reivindicación 1, para regular la transcipción de un ácido nucleico de interés.