VARIANTE GENETICA DEL GEN DE ANEXINA A5.

Molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de anexina A5 (ANXA5) humana,

promotor que comprende las siguientes mutaciones (sustituciones) puntuales (i) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 186 de la SEQ ID NO: 2; (ii) una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2; (iii)una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2; y (iv) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 276 de la SEQ ID NO:

La memoria descriptiva da a conocer una molécula de ácido nucleico que comprende un elemento de regulación del gen de anexina A5 (ANXA5) que comprende al menos una mutación puntual, mediante lo cual dicha al menos una mutación (sustitución) puntual se selecciona del grupo que consiste en (i) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 186 de la SEQ ID NO: 2; (ii) una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2; (iii) una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2; y (iv) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 276 de la SEQ ID NO: 2.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de anexina A5 (ANXA5) humana, promotor que comprende las siguientes mutaciones (sustituciones) puntuales: (i) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 186 de la SEQ ID NO: 2; (ii) una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2; (iii) una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2; y (iv) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 276 de la SEQ ID NO: 2. La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de anexina A5 (ANXA5) humana, promotor que comprende las siguientes mutaciones (sustituciones) puntuales: (ii) una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2; y (iii) una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2.

Además, la presente invención proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención y un huésped transformado con el vector. La invención también se refiere a usos específicos, en particular usos de diagnóstico de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente

documento. Además, la memoria descriptiva da a conocer un método para determinar el haplotipo de un elemento de regulación del gen ANXA5 en un individuo que comprende las etapas de: (a) aislar un ácido nucleico a partir de una muestra que se ha extraído del individuo; (b) determinar la presencia de los nucleótidos presentes en las posiciones 186, 203, 229 y 276 de la copia del individuo del elemento de regulación del gen ANXA5, en el que los números de posición se determinan mediante comparación con la SEQ ID NO: 2; (c) asignar a los individuos a un haplotipo particular mediante comparación de los nucleótidos presentes en dichas posiciones con los nucleótidos referidos en los haplotipos tal como se define en el presente documento.

El aborto es un fenómeno frecuente con origen heterogéneo. El estado genético más prevalente, especialmente para casos de pérdida en los primeros meses de embarazo, son las aberraciones cromosómicas. Los trastornos de hipercoagulabilidad que promueven trombosis, denominados colectivamente trombofilia son aún otro factor genético significativo. Los defectos más significativos (riesgo de 3 a 6 veces mayor de aborto) incluyen la mutación del factor V de Leiden, variantes genéticas de metilentetrahidrofolatorreductasa (MTHFR), y mutación 20210G→A del factor II (protrombina). Entre estos, se han demostrado las asociaciones del factor V de Leiden y la 20210G→A de protrombina (PTm) con el aborto recurrente mediante meta-análisis estadístico [Rey, 2003]. La asociación entre algunas de las variantes genéticas de MTHFR y la trombosis es controvertida [Rey, 2003, Key, 2002, Seligsohn, 2001]. Otro factor principal para las pérdidas repetidas del embarazo es la presencia de anticuerpos antifosfolípidos maternos circulantes (aPL). El aumento de los riesgos de aborto se ha documentado en embarazos de bajo riesgo y de alto riesgo (más de 3 muertes fetales), cuando están presentes aPL [Empson, 2002 y bibliografía en el mismo].

La anexina A5 (proteína anticoagulante placentaria) se encuentra en vellosidades placentarias normales y parece reducirse en presencia de aPL [Rand, 1994]. Otros estudios confirman la expresión de anexina A5 reducida en trofoblastos

placentarios de pacientes con preeclampsia mediante inmunohistoquímica.

La anexina A5 es un miembro típico de la familia de genes de anexina de cordados. Ésta proyecta la estructura de tétrada esencial y la unión a fosfolípidos dependiente de calcio, que se han convertido en un modelo clave para estudiar la función de la anexina [Gerke y Moss, 2002]. Es una proteína expresada de manera abundante y ubicua presente mayormente en el riñón, el hígado y la placenta [Morgan, 1998]. La anexina A5 puede funcionar de manera extracelular como un inhibidor de la coagulación sanguínea y se propone que esta proteína puede formar un escudo anticoagulante protector en la superficie de los trofoblastos placentarios [Rand y Wu, 1999; Rand, 2003].

Hayes trata el posible papel de la expresión de anexina 5 en algunos estados patológicos, tales como el aborto. Sin embargo no se sugiere que estos estados puedan estar relacionados con un promotor de ANXA5 mutado.

El gen de anexina A5 se ha caracterizado hace una década [Cookson, 1994] y el gen y la proteína codificada se estudian y caracterizan de manera extensa. Sin embargo, hasta hace poco, se conocía poco sobre la regulación de la expresión de anexina A5. El gen de anexina A5 (ANXA5) humana produce varios transcritos y tiene un promotor complejo con regulación intrincada [Carcedo, 2001].

No se han asociado mutaciones de anexina A5 con un fenotipo de enfermedad, a excepción de la variante genética “-1 CT”, que se propone que protege frente al infarto de miocardio en pacientes jóvenes [Gonzalez-Conejero, 2002]. Sin embargo existen otros datos y consideraciones, que refutan la validez de este hallazgo [Kozak, 2003; van Heerde, 2003].

El problema técnico de la presente invención es la provisión de medios y métodos para determinar el riesgo de aborto. La solución a este problema técnico se proporciona en la presente invención tal como se caracteriza en las reivindicaciones y tal como se ilustra y ejemplifica en el presente documento.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de anexina A5 (ANXA5) humana, promotor que comprende las siguientes mutaciones (sustituciones) puntuales: (i) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 186 de la SEQ ID NO: 2; (ii) una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2; (iii) una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2; y (iv) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 276 de la SEQ ID NO: 2. La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de anexina A5 (ANXA5) humana, promotor que comprende las siguientes mutaciones (sustituciones) puntuales: (ii) una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2; y (iii) una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende un elemento de regulación del gen de anexina A5 (ANXA5) que comprende las siguientes mutaciones (sustituciones) puntuales

(i) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 186 de la SEQ ID NO: 2; (ii)una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2; (iii)una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2; y (iv)una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 276 de la SEQ ID NO: 2.

Tal como se documentó en los ejemplos adjuntos, se encontró de manera sorprendente una variante genética en la región promotora de ANXA5 (BamHI) en el gen de anexina A5 (ANXA5) entre mujeres que se examinaron para determinar diferentes defectos genéticos de trombosis hereditarios debido a aborto repetido. Esta variante consiste en sustituciones de cuatro nucleótidos, que se heredan como un haplotipo. Sin restringirse a la teoría, estos cuatro cambios son importantes para la actividad del

promotor de anexina A5...

1. Molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de anexina A5 (ANXA5) humana, promotor que comprende las siguientes mutaciones (sustituciones) puntuales

(i) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 186 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2;

(iii)una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2; y

(iv) una mutación puntual de G por A en una posición que corresponde al nucleótido 276 de la SEQ ID NO: 2.

2. Molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de anexina A5 (ANXA5) humana, promotor que comprende las siguientes mutaciones (sustituciones) puntuales

(ii) una mutación puntual de A por C en una posición que corresponde al nucleótido 203 de la SEQ ID NO: 2; y

(iii)una mutación puntual de T por C en una posición que corresponde al nucleótido 229 de la SEQ ID NO: 2.

3. Fragmento de ácido nucleico de las moléculas de ácido nucleico definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende las sustituciones como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Oligómero que tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos, que hibrida específicamente con las moléculas/fragmentos de ácido nucleico como se define en una cualquiera de la reivindicación 1 a 3.

5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 que se une operativamente a un gen que codifica una proteína marcadora, una proteína señal, un gen reportero, o una etiqueta.

6. Molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 que es ADN, ARN o APN.

7. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 5.

8. Método in vitro para diagnosticar o detectar una predisposición para una tendencia al aborto (pérdida del embarazo) y/o un mayor riesgo para desarrollar anticuerpos antifosfolípidos, comprendiendo dicho método las etapas de

(a) examinar un promotor de ANXA5 para detectar al menos una sustitución según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; y

(b) determinar si está presente alguna de las al menos una de dichas sustituciones.

9. Método in vitro según la reivindicación 8, en el que la detección de dicha al menos una sustitución en dicho promotor de ANXA5 se lleva a cabo o se determina mediante técnicas de ácidos nucleicos basadas en el tamaño o la secuencia.

10. Método in vitro según la reivindicación 9, en el que dicha técnica basada en el tamaño o la secuencia se selecciona del grupo que consiste en técnicas de hibridación, secuenciación de ácidos nucleicos, PCR, determinación de fragmentos de restricción, determinación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), LCR (reacción en cadena de ligamiento) o determinación de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).

11. Método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende la etapa de amplificar un tramo de ADN del promotor de ANXA5 a partir del ADN genómico mediante PCR.

12. Método in vitro según la reivindicación 10, en el que dicha determinación de fragmentos de restricción o dicho RFLP comprende la determinación de un sitio de restricción BamHI.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que se determina la ausencia o la presencia de una sustitución correspondiente a la posición 276 de un promotor del gen ANXA5 tal como se muestra en la SEQ ID NO:

2.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, que se lleva a cabo en ADN genómico.

15. Uso de la molécula de ácido nucleico definida en la reivindicación 1 ó 2, el fragmento de ácido nucleico definido en la reivindicación 3, el oligómero de la reivindicación 4, o de un par de cebadores capaces de amplificar tramos relevantes de la molécula de ácido nucleico definida según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una composición de diagnóstico para diagnosticar o detectar una predisposición para o una tendencia al aborto y/o para diagnosticar o detectar una predisposición o una tendencia para el desarrollo de anticuerpos antifosfolípidos.

16. Método de selección de moléculas capaces de interaccionar con un promotor mutado de ANXA5 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende las etapas de

(a) poner en contacto una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, un vector según la reivindicación 7 ó un huésped que comprende dicha molécula de ácido nucleico con una molécula candidata;

(b) medir y/o detectar una respuesta;

(c) comparar dicha respuesta con una respuesta patrón tal como se mide en ausencia de dicha molécula candidata, y

(d) comparar dicha respuesta con una respuesta obtenida con dicha molécula candidata y el promotor no mutado (de tipo natural) de ANXA5.