INDUCCION XENOBIOTICA DE LA EXPRESION GENICA DEL CITOCROMO P450 CYP3A4.

Constructo genético, que comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos que forma un intensificador transcripcional de la producción o expresión del citocromo P450 CYP3A4,

y

(ii) un gen codificante de una molécula de informador,

en el que la secuencia de nucleótidos incluye cada uno de los elementos de respuesta nuclear siguientes de la región 5''-flanqueante de CYP3A4: SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5

Inducción xenobiótica de la expresión génica del citocromo P450 CYP3A4.

La presente invención se refiere a la modulación o realización de la expresión génica y/o a la formación de enzimas de la subfamilia del citocromo P450 CYP3A humano y animal no humano.

El desarrollo de fármacos terapéuticos para el uso médico y veterinario resulta importante para la mejora y el avance de las modalidades de tratamiento en seres humanos y animales. Por desgracia, se ha encontrado que muchos fármacos desarrollados y utilizados posteriormente presentan vidas medias limitadas in vivo debido al metabolismo rápido del receptor. Resultaría ventajoso disponer de un sistema para cribar nuevos fármacos potenciales para la susceptibilidad a la acción metabólica en los pacientes.

Un citocromo P450 (P450) denominado CYP3A4 es un gen humano importante que codifica un enzima expresado en el hígado y en menor grado en un abanico de otros tejidos. Cuantitativamente es el P450 más abundante en el hígado humano. El enzima CYP3A4 resulta crucial para el metabolismo de muchos compuestos químicos exógenos (xenobióticos), incluyendo fármacos terapéuticos, así como un abanico de compuestos endógenos, tales como las hormonas esteroideas. Los cambios del nivel de expresión de CYP3A4 pueden afectar drásticamente a la tasa de eliminación de los fármacos terapéuticos y, de esta manera, presentar un impacto sobre su efectividad. Un abanico de compuestos químicos exógenos, incluyendo algunos fármacos terapéuticos (en lo sucesivo denominados "inductores xenobióticos") son capaces de incrementar la tasa transcripcional del gen CYP3A4 y por lo tanto la formación del enzima CYP3A4. El resultado es un gran incremento de la eliminación de los fármacos metabolizados por CYP3A4, reduciendo de esta manera su efecto terapéutico.

Los presentes inventores han obtenido una molécula de ADN, situada aproximadamente a 7 kilobases en el lado 5' del sitio de inicio de transcripción del gen del P450 CYP3A4 humano, que es responsable de la inducción transcripcional del gen CYP3A4 por parte de inductores xenobióticos, incluyendo fármacos terapéuticos, y que también se encuentra implicada en la expresión constitutiva de dicho gen. Esta molécula de ácidos nucleicos, denominada "módulo intensificador sensible a los xenobióticos" (XREM) por los presentes inventores, presenta varios usos beneficiosos.

La referencia de Hashimoto et al., Eur. J. Biochem. 218:585-595, 1993, describe el gen CYP3A4, incluyendo la secuencia promotora proximal.

La referencia de Dogra et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 25 (enero de 1998):1-9, describe la activación transcripcional de genes P450 por diferentes clases de inductores químicos.

La referencia de Ogg et al., Eur. J. Drug Metabolism and Pharmacokinetics 22(4):311-313, 1997, describe un ensayo in vitro de un gen informador para la evaluación de la inducción xenobiótica del gen CYP3A4 humano.

La referencia Lehmann et al., J. Clin. Invest 5:1016-1023, 1998, describe la activación del receptor PXR nuclear huérfano humano por compuestos que regulan la expresión del gen CYP3A4 y provocan interacciones farmacológicas.

La referencia de Barwick et al., Mol. Pharm 50:16-26, 1996, describe la activación transcripcional inducible por glucocorticoides de CYP3A4 humano transitoriamente expresado y CYP3A6 de conejo en cultivos primarios de hepatocitos de rata y de conejo adulto.

La invención proporciona un constructo genético según se define en las reivindicaciones. La invención también proporciona un método según se define en las reivindicaciones.

La presente memoria proporciona una molécula aislada de ácidos nucleicos que incluye una secuencia de nucleótidos que forma un intensificador transcripcional de la producción o expresión del citocromo P450 (P450) CYP3A4.

Preferentemente, la molécula aislada de ácidos nucleicos incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual a la mostrada en la figura 1 (SEC ID nº 1) o una secuencia de nucleótidos funcionalmente equivalente o una porción de la misma, codificante de un intensificador de CYP3A4, o una secuencia que se hibrida con la secuencia de nucleótidos de la figura 1 (SEC ID nº 1), o una secuencia que muestra una homología de por lo menos 60% con la secuencia de nucleótidos de la figura 1 (SEC ID nº 1). Más preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos presenta una homología de por lo menos 80% con la secuencia de nucleótidos de la figura 1 (SEC ID nº 1) y más preferentemente la molécula de ácidos nucleicos presenta una homología de por lo menos 90% con dicha secuencia.

La presente memoria proporciona una molécula aislada de ácidos nucleicos que incluye elementos de respuesta de receptor nuclear de la región 5'-flanqueante de CYP3A4. Los elementos de respuesta son: XREM-DR3-1 GAA TGAACTTGC TGACCC TCT (SEC ID nº 2); XREM-ER6 CCT TGAAAT CATGTC GGTTCA AGC (SEC ID nº 3); XREM-DR6 AGG TGAATC ACAAGC TGAACT TCT (SEC ID nº 4) y XREM-DR3-2 ATA TATTGT TAT TGAACT ATC (SEC ID nº 5).

Debido a que los presentes inventores han identificado varios elementos de respuesta específicos en el intensificador de CYP3A4, se apreciará que la secuencia SEC ID nº 1 puede utilizarse para identificar otros elementos de respuesta. Debido a que la secuencia completa del intensificador no resulta necesaria para la utilización posterior, se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente invención la utilización de elementos de respuesta del intensificador con secuencias intermedias o conectoras procedentes de otras fuentes.

Preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos aislada presenta una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual a la mostrada en la figura 1 (SEC ID nº 1).

En una forma preferente, el CYP3A4 es CYP3A4 humano. Sin embargo, se apreciará que la presente invención también se refiere a otros enzimas de la subfamilia de CYP3A humana y a enzimas de la subfamilia CYP3A de animales no humanos.

La inducción de CYP3A4 preferentemente se debe a uno o más inductores xenobióticos.

La presente memoria también proporciona polinucleótidos que se hibridan con la secuencia mostrada en la figura 1 (SEC ID nº 1). Preferentemente, el polinucleótido se hibrida con la secuencia indicada en la figura 1 (SEC ID nº 1) bajo condiciones de alta astringencia. Tal como se utiliza en la presente memoria, las condiciones astringentes son aquéllas que: (a) utilizan una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/NaDodSO₄ al 0,1% a 50ºC, (b) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%, Ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC, o (c) utilizan formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 4 2ºC en 0,2xSSC y SDS al 0,1%.

El polinucleótido capaz de hibridarse con la secuencia de nucleótidos de la figura 1 (SEC ID nº 1) puede presentar una longitud inferior a 5.000 nucleótidos, sin embargo, puede presentar una longitud inferior a 1.000, o incluso inferior a 500 nucleótidos. Preferentemente, los polinucleótidos hibridantes presentan una longitud de por lo menos 10, más preferentemente de por lo menos 18 nucleótidos.

En una realización, la presente invención proporciona un constructo genético adecuado para la utilización en la medición del grado de inducción de un gen informador, incluyendo el constructo una molécula de ácidos nucleicos según el primer aspecto de la presente invención (según las reivindicaciones) operablemente ligada a una molécula de ácidos nucleicos codificante de una molécula de informador.

Preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos codificante de la molécula de informador codifica un enzima. La molécula de ácidos nucleicos codificante del informador puede codificar el enzima CYP3A4 o un enzima funcionalmente equivalente. Entre los ejemplos de moléculas informadoras adecuadas se incluyen la luciferasa de luciérnaga, la beta-galactosidasa, la cloranfenicol acetiltransferasa, la fosfatasa alcalina y la proteína fluorescente verde. Alternativamente, el ácido nucleico puede...

1. Constructo genético, que comprende:

en el que la secuencia de nucleótidos incluye cada uno de los elementos de respuesta nuclear siguientes de la región 5'-flanqueante de CYP3A4: SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5.

2. Constructo genético según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es SEC ID nº 1.

3. Constructo genético según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además una secuencia de nucleótidos de secuencia SEC ID nº 6.

4. Constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula de ácidos nucleicos forma un intensificador transcripcional que resulta activado en respuesta a la rifampicina.

5. Constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula de informador es la luciferasa de luciérnaga, la beta-galactosidasa, la fosfatasa alcalina, la proteína fluorescente verde o la cloranfenicol acetiltransferasa.

6. Célula que comprende un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Método para el cribado de un compuesto para la inducción xenobiótica de la expresión de CYP3A4 en una célula, que incluye exponer un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 a un compuesto y medir la inducción o el potencial de expresión de la molécula de ácidos nucleicos codificante de la molécula de informador.