MODELO DE ROEDOR PARA LA RÁPIDA IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS ACTIVOS FARMACÉUTICOS IN VIVO.

Modelo de roedor para la rápida identificación de compuestos activos farmacéuticos in vivo. Esta invención se refiere a un modelo de roedor para crecimiento neoplásico, en particular crecimiento canceroso. Específicamente, el modelo de roedor permite la identificación de compuestos activos farmacéuticos in vivo, comprendiendo el uso de células tumorales transfectadas de manera estable con un vector de expresión que comprende un gen indicador operativamente unido a un promotor que también controla la expresión de una proteína asociada con regresión tumoral, estabilización del crecimiento tumoral o inhibición de la metástasis. Antecedentes de la invención Desde hace tiempo ha habido una necesidad de un modelo animal no humano representativo para someter a prueba la eficacia de nuevos agentes antineoplásicos propuestos sin tener que realizar estudios de xenoinjertos a largo plazo. Los presentes modelos in vivo con los que se someten a prueba posibles agentes antineoplásicos implican implantar células tumorales en un animal no humano, tratar el animal con el nuevo agente antineoplásico propuesto y monitorizar entonces los animales para determinar el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor. Para ayudar a la visualización de las células tumorales contra el fondo de las células huésped, muchos modelos in vivo usan células tumorales transfectadas de manera estable con un gen indicador tal como la familia luciferasa y la familia aecuorina de moléculas bioluminiscentes. Una desventaja importante de estos modelos in vivo, en el desarrollo de agentes antitumorales, es el rendimiento limitado, es decir, se requiere un gran número de animales y una gran cantidad del compuesto antitumoral propuesto. Además, estos modelos in vivo llevan mucho tiempo, ya que requieren un tiempo suficiente para que el tumor implantado crezca en el animal. Por consiguiente, se propuso recientemente un modelo mejorado por Lassota P. en la solicitud internacional de patente (PCT/EP02/00106) publicada como WO 02/055742 el 18 de julio de 2002. En este modelo, se hacen crecer las células tumorales con un gen indicador, que se activa mediante el agente antitumoral, en un dispositivo de encapsulación semipermeable biocompatible, que se implanta en el animal no humano y se extrae tras la exposición del animal al compuesto que va a someterse a prueba. Sin embargo, en vista del entorno artificial de las células tumorales, es cuestionable si la respuesta de las células tumorales imita realmente la situación in vivo en la que un compuesto tiene que introducirse en la circulación, infiltrarse en el tejido tumoral y ejercer su efecto biológico. Sambucetti et al. (Histone deacetylase inhibition selectively alters the activity and expression of cell cycle proteins leading to specific chromatin acetylation and antiproliferative effects J. Biol. Chem., vol. 274, n.º 49, 3 de diciembre de 1999, págs. 34940-34947) da a conocer células tumorales transfectadas de manera transitoria con un constructo génico p21 WAF -Luc. Xiao et al. (Sodium butyrate induces NIH3T3 cells to senescence-like state and enhances promotor activity of p21 WAF/CIP-1 in p53-independent manner, Biochem. Biophys. Res. Comm., vol. 237, 1997, págs. 457-460) da a conocer un promotor de p21WAF/CIP-1 en el que se han delecionado dos elementos de respuesta a P53, se ha ligado a un gen indicador de luciferasa y se ha transfectado en una línea celular de fibroblastos NIH3T3. Por consiguiente, para satisfacer la necesidad de un modelo animal no humano para enfermedad neoplásica humana, que no tiene las deficiencias mencionadas anteriormente, la presente invención da a conocer un modelo de roedor que tiene la capacidad de imitar realmente la actividad farmacológica de un compuesto antineoplásico propuesto in vivo. Un modelo que permite la monitorización de la actividad antineoplásica de un compuesto de una forma no invasiva y que comprende el uso de células tumorales transformadas de manera estable, que se habían transfectado con un vector de expresión que contiene un gen indicador operativamente unido a un promotor que también controla la expresión de una proteína que está asociada con regresión tumoral. Con el fin de proporcionar el modelo animal deseado, las células deben: - conservar la capacidad para formar un tumor cuando se implantan o inyectan en el animal; - generar una señal que es análoga a la respuesta endógena de una proteína asociada con regresión tumoral; - generar una señal con una buena razón de señal con respecto a ruido, para permitir un análisis en tiempo real del efecto cinético de sustancias farmacológicas in vivo; - generar una señal con una buena reproducibilidad para proporcionar una baja variabilidad entre animales; y - generar una señal que permite una obtención de imágenes no invasiva de la respuesta inducida. Sumario de la invención En un primer aspecto, la presente invención proporciona una línea celular tumoral transformada de manera estable 2   que se ha transfectado con un vector de expresión que contiene un gen indicador operativamente unido a un promotor, en la que el gen indicador consiste en una proteína fluorescente y en la que dicho promotor consiste en un fragmento de promotor de p21 definido por SEQ ID NO: 1. En comparación con los modelos in vivo tradicionales, la presente invención difiere en que el gen indicador no se expresa de manera constitutiva, sino sólo tras la exposición a un compuesto de prueba que da como resultado la expresión de una proteína o enzima asociada con regresión tumoral. Sólo cuando un compuesto que va a someterse a prueba se introduce en la circulación y se infiltra en el tumor, puede generar la señal del indicador, siempre que promueva la expresión de una proteína asociada con regresión tumoral y el promotor de dicha proteína esté operativamente unido al gen indicador. El modelo es sumamente ventajoso con respecto a modelos in vivo previos, puesto que el tiempo de recambio para someter a prueba la actividad farmacéutica in vivo de compuestos antineoplásicos propuestos se reduce. En los modelos in vivo tradicionales, normalmente se tarda de 4 a 5 semanas en obtener un resultado, en el presente modelo, una vez que se forma el tumor en el animal no humano, es posible observar los efectos de un compuesto de prueba en un par de días. Además, en vista de la claridad y reproducibilidad de la señal fluorescente, los tumores pueden observarse a través de la piel y medirse usando un sistema de obtención de imágenes de cuerpo completo automatizado. Como consecuencia, se necesita un número inferior de animales para obtener efectos estadísticos significativos. Una ventaja adicional del presente modelo animal es la sensibilidad y receptividad de la señal fluorescente dentro de un amplio intervalo de concentración del compuesto de prueba. Esta combinación permite realizar un análisis cinético en tiempo real para determinar la actividad in vivo del compuesto de prueba y predecir la eficacia antitumoral del compuesto de prueba cuando se combina con el cambio en el peso del tumor observado. Esta combinación de características permite la obtención de imágenes no invasiva tras cantidades limitadas de dosificación con el compuesto de prueba (4 días en lugar del periodo tradicional de 30 días), conduciendo a una disminución del tiempo experimental y por tanto del compuesto de prueba, así como a una disminución en el sufrimiento de los animales y la ocupación de las instalaciones para animales. La proteína p21 actúa como inhibidor de la actividad cinasa dependiente de ciclinas y detiene eficazmente la progresión del ciclo celular. Se ha mostrado una amplia variedad de agentes antitumorales que activan el promotor de p21, incluyendo agentes que dañan el ADN e inhibidores de histona desacetilasa que activan el promotor de p21 a través del elemento de respuesta a p53 (ubicado en la región de -4500 pb a -1300 pb en relación con la caja TATA) o sitios sp1 (ubicados en la región de -60 pb a +40 pb en relación con la caja TATA), respectivamente y que conducen a un aumento de la expresión de la proteína p21. En la presente invención, se usa un promotor de p21 que consiste en un fragmento de promotor de p21 definido por SEQ ID No:1, caracterizado porque dicho fragmento de promotor no comprende los elementos de respuesta a p53 y por consiguiente no responde a elementos que dañan el ADN. Un promotor de p21 que consiste en un promotor de p21 que comprende los elementos de respuesta a p53, respondiendo dicho promotor de p21 a agentes que dañan el ADN definidos por SEQ ID No:1. Alternativamente, se describe un promotor que responde a agentes que dañan el ADN que consiste en un promotor mínimo tal como el promotor basal de timidina cinasa del virus del herpes simple (VHS-TK) que comprende al menos un elemento de respuesta a p53. La presente invención... [Seguir leyendo]

1. Célula tumoral transformada de manera estable que se ha transfectado con un vector de expresión que contiene un gen indicador operativamente unido a un promotor, en la que el gen indicador consiste en una proteína fluorescente, y en la que dicho promotor consiste en un fragmento de promotor de p21 definido por SEQ ID NO:1. 2. Célula tumoral según la reivindicación 1, consistiendo las células tumorales transformadas de manera estable en células de carcinoma de ovarios o células de carcinoma colorrectal transformadas de manera estable. 3. Célula tumoral según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la proteína fluorescente se selecciona del grupo que consiste en EGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, ZsYellow, HcRed o proteínas fluorescentes desestabilizadas tales como pDsRed, pHcRed1, pd2EGFP o pd2EYFP. 4. Célula tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 depositada en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos como pGL3-basic-ZsGreen-1300-clon 1 el 20 de enero de 2003 con el número de registro LMBP 5958CB. 5. Célula tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 depositada en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos como pGL3-basic-ZsGreen-1300-clon 2 el 20 de enero de 2003 con el número de registro LMPB 5959CB. 6. Modelo de roedor para examinar la actividad farmacéutica de un compuesto, comprendiendo dicho modelo de roedor una célula tumoral transformada de manera estable según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 7. Roedor según la reivindicación 6, en el que las células tumorales transformadas de manera estable se inyectan o se implantan quirúrgicamente bajo la piel del roedor. 8. Método para preparar un roedor según la reivindicación 6 ó 7, método que comprende administrar a dicho roedor una cantidad de células según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 suficiente para efectuar la producción de un tumor en dicho roedor. 9. Método según la reivindicación 8, en el que el roedor está genéticamente inmunocomprometido o es singénico con dicho tumor. 10. Método in vitro de examen de un compuesto para determinar la actividad antineoplásica, que comprende las etapas de: poner en contacto las células tumorales según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con el compuesto que va a someterse a prueba; y medir la expresión del gen indicador. 11. Método de examen de un compuesto para determinar la actividad farmacéutica, que comprende las etapas de: proporcionar un roedor según la reivindicación 6 ó 7 al que se le ha administrado un compuesto potencialmente activo; y evaluar el efecto de dicho compuesto sobre las células tumorales midiendo la expresión del gen indicador. 19     21   22   23