Método in vitro y kit para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNF{al} por parte de pacientes con artritis reumatoide,

que comprende la determinación en una muestra de sangre de dichos pacientes del nivel de expresión de al menos uno de los ocho genes seleccionado del grupo: HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, IL2RB, MXD4 y TLR5 o de combinaciones de los mismos y la comparación de dicho nivel de expresión con respecto a los valores de expresión obtenidos de pacientes respondedores al tratamiento y no respondedores al mismo

Método in vitro y kit para el pronóstico o predicción de la respuesta por parte de pacientes con artritis reumatoide al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNFα.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro (en adelante método de la invención) para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor necrosis tumoral alfa (TNFα), como por ejemplo infliximab o adalimumab, por parte de pacientes con artritis reumatoide. Así, la presente invención puede englobarse dentro del campo de la medicina personalizada, de la reumatología o de la genética humana como campo que estudia las enfermedades de base genética.

Estado de la técnica

La artritis reumatoide (AR) es una de las enfermedades autoinmunes más frecuentes en el mundo (prevalencia mundial ∼ 1%). La AR conduce a la inflamación crónica de las articulaciones sinoviales y al desarrollo de daño articular progresivo que puede dar lugar a una marcada incapacidad funcional. Además, la AR es una enfermedad muy heterogénea y compleja en todos sus aspectos, incluyendo tanto sus manifestaciones clínicas como la variabilidad en su respuesta a las diferentes terapias.

Fruto de la intensa investigación llevada a cabo durante los últimos anos, se han identificado varios tratamientos para el control de la AR. Durante la última década las terapias biológicas que inhiben el TNFα han tenido un mayor desarrollo, con respecto al control de la AR, en comparación con terapias basadas en DMARD (medicamentos antirreumáticos modificadores de la enfermedad).

Actualmente el infliximab es una de las terapias más usadas para el tratamiento de la AR. El infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico (IgG) derivado de un ADN recombinante de origen humano y murino, que se une y neutraliza al TNFα, logrando interrumpir la cascada secuencial de activación de las vías inflamatorias mediadas por esta citoquina.

Sin embargo, existe un porcentaje de pacientes que no responden al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNFα y deben ser redirigidos hacia terapias alternativas. Por lo tanto, los métodos para el pronóstico o predicción de los pacientes que se pueden beneficiar de este tratamiento y su diferenciación de los pacientes no respondedores a dicho tratamiento que serán focalizados hacia terapias alternativas, son una necesidad creciente dirigida hacia el reto que supone la medicina individualizada.

En el documento ["Gene profiling in white blood cells predicts infliximab responsiveness in rheumatoid arthritis". Thierry Lequerré et al.] se divulga el estudio del perfil de expresión génico (mediante la cuantificación del nivel de ARNm) en células mononucleares periféricas (PBMCs) (lo que supone una fracción de menos del 60% de las células de la sangre), como base para la predicción de la respuesta a infliximab por parte de pacientes con AR. Se determinaron un grupo de genes correlacionados con la respuesta al tratamiento. Los genes estudiados se muestran en las diferentes tablas y figuras de este documento, siendo el listado más completo el comprendido en la Tabla 4.

En el documento ["Effect of infliximab therapy on gene expression levels of tumor necrosis factor alpha, tristetraprolin, T cell intracellular antigen 1, and Hu antigen R in patients with rheumatoid arthritis". Sugihara, Makoto et al.] se llevó a cabo la identificación de parámetros que puedan predecir, en pacientes con AR, la eficacia de la terapia anti-TNFα. Para ello se analizó el nivel de expresión de los genes TNFα, TTP, TIA-1 y HuR concluyendo que las diferencias de expresión en genes ABP (TTP, TIA-1 y HuR) puede afectar a la expresión del gen TNFα. Un ratio de expresión TIA-1:HuR elevado podría estar relacionado con la respuesta del paciente al tratamiento con infliximab.

En el documento ["Effect of infliximab on mRNA expression profiles in synovial tissue of rheumatoid arthritis patients". Johan Lindberg et al.] se divulga el examen realizado del perfil de expresión génica de pacientes aquejados con AR para investigar si dichos perfiles pueden ser utilizados para predecir la respuesta de los pacientes al tratamiento con infliximab. Para ello se estudió el perfil de expresión de una serie de genes como MMP-3 y otros citados en la página 5 (columna izquierda segundo párrafo).

Ninguno de los documentos localizados en el estado de la técnica describe ninguno de los ocho genes, cuyo nivel de expresión es analizado en la presente invención: HLA-DRB3 (NCBI: 3125), EAT2 (NCBI: 117157), GNLY (NCBI: 10578), CAMP (NCBI: 820), SLC2A3 (NCBI: 6515), IL2RB (NCBI: 3560), MXD4 (NCBI: 10608) y TLR5 (NCBI: 7100). Por lo tanto, no existe en el estado de la técnica ninguna evidencia relacionada con la utilización de los ocho genes arriba citados, los cuales tal y como se explica en la descripción de la invención han sido específicamente seleccionados en la presente invención mediante un exhaustivo proceso de cribado entre miles de genes.

Es importante hacer notar que aunque en la presente invención el modelo predictor óptimo es el que considera la expresión del conjunto de los ocho genes arriba citados a la vez, cada uno de estos ocho genes tiene potencial predictivo por sí mismo. Por lo tanto en el método de la invención podría utilizarse, con suficientes visos de efectividad, cualquiera de los ochos genes arriba mencionados, cualquier sub-combinación de los ocho genes con un número de genes ≥q 2 o el conjunto de los ocho genes, en su totalidad.

Además, otra diferencia importante del método de la invención con respecto a los métodos divulgados en el estado de la técnica se refiere a la naturaleza de la muestra biológica usada para el análisis de la expresión génica. En la presente invención y a diferencia del estado de la técnica, se aísla y se analiza el ARNm de sangre total, sin realizar ningún fraccionamiento previo. El perfil de expresión, por tanto, incluye todas las poblaciones celulares de la sangre. Este aspecto adquiere importancia al tener en cuenta que cada tipo o población celular pueden tener asociados diferentes perfiles de expresión génica.

El tipo de muestra tomada en la presente invención (sangre total) hace que el método sea muy poco invasivo para el paciente y constituye otra diferencia respecto a algunos de los métodos conocidos donde se realizan biopsias sinoviales para la extracción de las muestras.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNFα por parte de pacientes con artritis reumatoide, que comprende la determinación en una muestra de sangre de dichos pacientes y mediante la cuantificación del nivel de expresión transcripcional (ARNm), de al menos uno de los ocho genes seleccionado del grupo: HLA-DRB3 (NCBI: 3125), EAT2 (NCBI: 117157), GNLY (NCBI: 10578), CAMP (NCBI: 820), SLC2A3 (NCBI: 6515), IL2RB (NCBI: 3560), MXD4 (NCBI: 10608) y TLR5 (NCBI: 7100); y la comparación de dicho nivel de expresión con respecto a los valores de expresión previamente obtenidos de pacientes que demostraron ser respondedores al tratamiento o no respondedores al mismo.

Además la presente invención se refiere a un kit para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNFα por parte de pacientes con artritis reumatoide, que comprende al menos una sonda que hibride con al menos una de las secuencias nucleotídicas de los siguientes genes: HLA-DRB3 (NCBI: 3125), EAT2 (NCBI: 117157), GNLY (NCBI: 10578), CAMP (NCBI: 820), SLC2A3 (NCBI: 6515), IL2RB (NCBI: 3560), MXD4 (NCBI: 10608) y TLR5 (NCBI: 7100).

Las sondas comprendidas en el kit se caracterizan por las secuencias SEQ ID NO: 1-8.

Tal y como se observa en las Figuras 2-9, debe tenerse en cuenta que los genes sobreexpresados en pacientes no respondedores antes de iniciar el tratamiento son: MXD4, HLA-DRB3, IL2RB, EAT2, GNLY y los genes sobreexpresados en pacientes respondedores antes de iniciar el tratamiento son: TLR5, CAMP, SLC2A3.

Por otro lado comentar que los genes HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, IL2RB y TLR5, están todos ellos relacionados con la respuesta inmune.

Así, el problema técnico resuelto por la presente invención...

1. Método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNFα por parte de pacientes con artritis reumatoide, que comprende la determinación en una muestra de sangre de dichos pacientes del nivel de expresión de al menos el gen IL2RB y la comparación de dicho nivel de expresión con respecto a los valores de expresión obtenidos de pacientes respondedores al tratamiento y no respondedores al mismo.

2. Método in vitro, según la reivindicación 1, que además comprende la determinación del nivel de expresión de al menos uno de los siete genes seleccionados del grupo: HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, MXD4 y TLR5.

3. Método in vitro, según las reivindicaciones 1 y 2, que comprende la determinación del nivel de expresión conjunto de los seis genes seleccionados del grupo: IL2RB, HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, y TLR5.

4. Método in vitro, según la reivindicación 3, que además comprende la determinación del nivel de expresión del gen: SLC2A3.

5. Método in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, que además comprende la determinación del nivel de expresión del gen: MXD4.

6. Método in vitro, según las reivindicaciones 1 y 2, que comprende la determinación del nivel de expresión conjunto del grupo de ocho genes que comprende: IL2RB, HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, MXD4 y TLR5.

7. Método in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los genes IL2RB, MXD4, HLA-DRB3, EAT2, GNLY están sobreexpresados en pacientes no respondedores antes de iniciar el tratamiento y los genes TLR5, CAMP, SLC2A3 están sobreexpresados en pacientes respondedores antes de iniciar el tratamiento.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el nivel de expresión de los genes es determinado mediante la cuantificación del nivel de ARNm en la muestra de sangre.

9. Método in vitro, según la reivindicación 1, caracterizado porque el agente bloqueante del factor TNFα es un anticuerpo anti-TNFα.

10. Método in vitro, según la reivindicación 9, caracterizado porque el agente bloqueante del factor TNFα es infliximab.

11. Método in vitro, según la reivindicación 9, caracterizado porque el agente bloqueante del factor TNFα es adalimumab.

12. Uso del gen L2RB para la construcción de un kit destinado a la predicción de la respuesta por parte de pacientes aquejados de artritis reumatoide al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNFα.

13. Uso según la reivindicación 12 que además comprende el uso de al menos uno de los siete genes seleccionados del grupo: HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, MXD4 y TLR5.

14. Kit para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNFα; por parte de pacientes con artritis reumatoide, que comprende una sonda que hibride con la secuencia nucleotídica del gen IL2RB.

15. Kit según la reivindicación 14 que además comprende al menos una de las sondas que hibride con al menos una de las secuencias nucleotídicas de al menos unos de los siete genes seleccionados entre: HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, MXD4 y TLR5.

16. Kit según las reivindicaciones 14 y 15 que comprende el conjunto de las seis sondas que hibridan con las seis secuencias nucleotídicas de los seis genes seleccionados entre: IL2RB, HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP y TLR5.

17. Kit según la reivindicación 16 que además comprende la sonda que híbrida con la secuencia nucleotídica del gen SLC2A3.

18. Kit según las reivindicaciones 16 o 17 que además comprende la sonda que híbrida con la secuencia nucleotídica del gen MXD4.

19. Kit según las reivindicaciones 14 y 15 que comprende el conjunto de las ocho sondas que hibridan con las ocho secuencias nucleotídicas de los ocho genes seleccionados entre: IL2RB, HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, MXD4 y TLR5.

20. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen IL2RB está caracterizada por la SEQ ID NO: 6.

21. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen HLA-DRB3 está caracterizada por la SEQ ID NO: 1.

22. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen EAT2 está caracterizada por la SEQ ID NO: 2.

23. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen GNLY está caracterizada por la SEQ ID NO: 3.

24. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen CAMP está caracterizada por la SEQ ID NO: 4.

25. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que híbrida con el gen SLC2A3 está caracterizada por la SEQ ID NO: 5.

26. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que híbrida con el gen MXD4 está caracterizada por la SEQ ID NO: 7.

27. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que híbrida con el gen TLR5 está caracterizada por la SEQ ID NO: 8.