MARCADORES GENETICOS DEL RIESGO DE SUFRIR REESTENOSIS.
La presente invención contempla un método para la determinación del riesgo de un individuo de sufrir reestenosis tras la implantación de un stent basado en el análisis de una muestra para determinar el genotipo en al menos un polimorfismo de base única (SNP) seleccionado entre rs350099,
rs350104, rs164390 y rs875459, en el gen CCNB1, y, opcionalmente de rs2282411 y/o rs733590, en los genes CCNA1 y CDKN1A, respectivamente, donde la presencia de determinados alelos en alguno de estos polimorfismos es indicativa del riesgo de sufrir reestenosis
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200900507.
Solicitante: FINA BIOTECH, S.L.U.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MADRID.
Inventor/es: FERNANDEZ FERRI,PATRICIA, SANCHEZ FERNANDEZ,PEDRO LUIS, CHAVES MARTINEZ,FELIPE JAVIER, SILVESTRE ROIG,CARLOS, ANDRES GARCIA,VICENTE, FERNANDEZ AVILES,FRANCISCO.
Fecha de Solicitud: 24 de Febrero de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 13 de Junio de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68M6
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2344396_B1.pdf
Fragmento de la descripción:
Marcadores genéticos del riesgo de sufrir reestenosis.
Campo de la invención
La presente invención tiene su aplicación dentro del sector sanitario, en el campo de la Biología Molecular. En concreto, esta invención está dirigida a un método de diagnóstico del riesgo de sufrir reestenosis tras revascularización mediante implantación de stent basado en la detección de polimorfismos de base única (SNPs).
Antecedentes de la invención
El tratamiento más frecuentemente utilizado en clínica para la revascularización de vasos afectados de arteriosclerosis es la angioplastia percutánea transluminal (APCT). Un proceso patológico frecuentemente asociado a esta intervención es la reestenosis, consistente en la reoclusión excesiva del vaso intervenido. La reestenosis tiene un elevado impacto sanitario y socio-económico, pues obliga a repetir la APCT o a someter al paciente afectado a terapias alternativas de revascularización (por ejemplo, "by-pass" aortocoronario). En comparación con la lesión ateromatosa nativa, caracterizada por un lento desarrollo (típicamente a lo largo de décadas), la lesión reestenótica suele crecer durante los primeros 4-12 meses después de la APCT (Serruys, Kutryk and Ong, "Coronary-artery stents", N Engl J Med 2006, 354, 483-95). Actualmente más del 90% de las APCT utilizan endoprótesis metálicas de soporte denominadas stents que aumentan la seguridad del procedimiento de intervención y han reducido las tasas de reestenosis a un 15-30%, comparado con tasas del 25-50% típicamente asociadas a APCT convencional (Serruys, Kutryk and Ong, "Coronary-artery stents", N Engl J Med 2006, 354, 483-95, Andrés, "Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling: new perspectives and therapeutic potential", Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21). Las tasas de reestenosis se reducen aún más con el uso de stents liberadores de fármacos.
La reestenosis es un proceso multifactorial en el que intervienen diversos tipos celulares, principalmente plaquetas, monocitos/macrófagos, células endoteliales (CEs), y células musculares lisas (CMLs). Se acepta que el crecimiento de la lesión reestenótica, también llamada lesión neoíntima, es un proceso iniciado por el daño mecánico que provoca la implantación del stent (Andrés, "Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling: new perspectives and therapeutic potential", Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21, Costa and Simon, "Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents", Circulation 2005, 111, 2257-73). La fase aguda inicial de la reestenosis supone una activación plaquetaria y trombosis localizada, acompañada del reclutamiento de monocitos, neutrófilos y linfocitos circulantes en la superficie arterial dañada. Estos tipos celulares desencadenan una respuesta inflamatoria crónica caracterizada por la activación de las CMLs residentes en la túnica media, las cuales adoptan un fenotipo "sintético" caracterizado por cambios morfológicos, expresión de isoformas embrionarias de proteínas contráctiles, alta capacidad de respuesta a estímulos de crecimiento y quimiotácticos, y síntesis abundante de matriz extracelular. Una plétora de factores quimiotácticos y mitogénicos producidos por las células de la lesión neointima provoca una primera fase proliferativa de las CMLs de la media y su migración hacia la lesión, seguida por una segunda respuesta hiperplásica de las CMLs de la lesión neoíntima (Andrés, "Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling: new perspectives and therapeutic potential", Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21, Costa and Simon, "Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents", Circulation 2005, 111, 2257-73). La resolución de la inflamación y cicatrización de la lesión vascular en etapas posteriores de la APCT va acompañada de la restauración del fenotipo contráctil de las CMLs de la neoíntima y cambios en la composición de la matriz extracelular que se asemeja más a la pared arterial no dañada. Como se ha indicado anteriormente, si la reestenosis es excesiva reaparecen los síntomas clínicos obligando a una nueva intervención revascularizante.
Entre los reguladores de la hiperplasia de la neoíntima identificados en estudios animales y humanos se incluyen factores trombogénicos (por ejemplo, el factor tisular, receptor de la trombina), moléculas de adhesión celular (por ejemplo, VCAM, ICAM, LFA-1, Mac-1), transductores de señales (por ejemplo, PI3K, MEK/ERK), factores de transcripción (por ejemplo, NF-κB, E2F, AP-1, c-myc, c-myb, YY1, Gax), proteínas reguladoras del ciclo celular (por ejemplo, pRb, p21, p27, CDK2, CDC2, ciclina B1, PCNA), factores de crecimiento (por ejemplo, PDGF-BB, TGFβ, FGF, IGF, EGF, VEGF), citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TNFα), factores de quimiotaxis (por ejemplo, CCR2, MCP-1), y metaloproteasas (por ejemplo, la MMP-2, MMP-9).
El carácter esencialmente hiperproliferativo de la reestenosis ha generado un gran interés en el estudio del papel que pueden jugar en este proceso patológico los genes reguladores del ciclo celular. En mamíferos, el ciclo celular se regula positivamente por holoenzimas compuestos por una subunidad catalítica denominada quinasa dependiente de ciclina (CDK, cyclin-dependent kinase) y una subunidad reguladora denominada ciclina (Ekholm and Reed, "Regulation of G(1) cyclin-dependent kinases in the mammalian cell cycle", Curr Opin Cell Biol 2000, 12, 676-84). La activación secuencial de las CDK/ciclinas permite diversos eventos de fosforilación de substratos celulares implicados en la proliferación celular. Por otro lado, existen proteínas inhibidoras de CDKs/ciclinas denominadas CKIs (CDK inhibitors), las cuales se subdividen en las subfamilias CIP/KIP (p21, p27 y p57) e INK4 (p15, p16, p18, y p19). La acumulación de CKIs en respuesta a estímulos anti-mitogénicos provoca la inhibición reversible de los complejos CDK/ciclina. La importancia de estas moléculas en el desarrollo de la lesión neoíntima se ha puesto de manifiesto gracias a estudios de expresión y experimentos de terapia génica. Así, el análisis de lesiones vasculares obstructivas inducidas por daño mecánico en modelos animales y humanos de angioplastia ha revelado alteraciones en la expresión de genes reguladores del ciclo celular (por ejemplo, CDKs, ciclinas, CKIs, p53, pRb), y numerosos estudios en animales experimentales han demostrado que la inactivación de CDKs y ciclinas (por ejemplo, ciclina B, CDK2, CDK1), o la sobreexpresión de supresores de crecimiento (por ejemplo p21, p27, pRb, p53) inhibe el desarrollo de lesiones vasculares obstructivas tras angioplastia (Andrés, "Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling: new perspectives and therapeutic potential", Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21, Nabel, "CDKs and CKIs: molecular targets fortissue remodelling", Nat Rev Drug Discov 2002, 1, 587-98, Dzau, Braun-Dullaeus and Sedding, "Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies", Nat Med 2002, 8, 1249-56).
Numerosos abordajes terapéuticos de carácter sistémico para la prevención o tratamiento de la reestenosis que mostraron resultados alentadores en modelos animales no han dado resultados satisfactorios en ensayos clínicos. Sin embargo, la reciente introducción de los stents liberadores de drogas antiproliferativas (ST-DA) ha revolucionado la cardiología intervencionista. Cabe destacar el uso de stents liberadores de sirolimus (también llamado rapamicina o rapamune) y de paclitaxel (también llamado taxol), fármacos lipofílicos que tienen como diana la ruta final común de la proliferación celular, el ciclo de la célula eucariota. Estos dispositivos liberan dosis elevadas del fármaco de un modo localizado en la pared arterial dañada y su uso ha reducido muy significativamente las tasas de reestenosis (Costa and Simon, "Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents", Circulation 2005, 111, 2257-73, Wessely, Schomig and Kastrati, "Sirolimus and Paclitaxel on polymer-based drug-eluting stents: similar but different", J Am Coll Cardiol 2006, 47, 708-14). Por este motivo, actualmente en Europa se implantan 2 ST-DAs de cada 3 stents implantados (Baz, Mauri, Albarran and Pinar, "[Spanish Cardiac Catheterization and Coronary Intervention Registry. 16th Official Report of the... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Empleo de un polimorfismo seleccionado de entre SNP1, SNP2, SNP3, SNP4 y sus combinaciones, del gen CCNB1, tal y como se definen en la figura 3, como marcador del riesgo de un individuo de sufrir reestenosis tras la implantación de un stent.
2. Método para la determinación del riesgo de un individuo de sufrir reestenosis tras la implantación de un stent que comprende: a) obtener el ADN de una muestra del individuo; b) analizar dicha muestra para determinar el genotipo de al menos un polimorfismo de base única (SNP) seleccionado entre SNP1, SNP2, SNP3 y SNP4, en el gen CCNB1. tal y como se definen en la figura 3, donde la presencia del genotipo TT de SNP1, del genotipo CC de SNP2, del genotipo GG de SNP3 y del genotipo GG de SNP4, es indicativa del riesgo de sufrir reestenosis.
3. Método, según la reivindicación 2, donde el paso b) comprende determinar el genotipo de los polimorfismos SNP1 y SNP2.
4. Método, según la reivindicación 2, donde la muestra de ADN se obtiene de saliva, sangre o leucocitos purificados a partir de sangre.
5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, que comprende adicionalmente determinar el genotipo del polimorfismo SNP5, del gen CCNA1. tal y como se define en figura 3, donde la presencia del genotipo TT o TC, en un modelo de codominancia, o del genotipo GG, en un modelo de dominancia, es indicativa del riesgo de sufrir reestenosis.
6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente determinar el genotipo del polimorfismo SNP6, del gen CDKN1A, tal y como se define en la figura 3, donde la presencia del genotipo TT, es indicativa del riesgo de sufrir reestenosis.
7. Kit para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 2-6 que comprende un set de oligonucleótidos y reactivos adecuados para la determinación del genotipo de al menos un SNP del gen CCNB1, seleccionado entre SNP1, SNP2, SNP3, SNP4, y sus combinaciones.
8. Kit, según la reivindicación 7, donde la determinación del genotipo de SNP1 se lleva a cabo mediante el par de oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO 7 y 8.
9. Kit, según la reivindicación 7, donde la determinación del genotipo de SNP2 se lleva a cabo mediante el par de oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO 9 y 10.
10. Kit, según la reivindicación 7, donde la determinación del genotipo de SNP3 se lleva a cabo mediante el par de oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO 11 y 12.
11. Kit, según la reivindicación 7, donde la determinación del genotipo de SNP4 se lleva a cabo mediante el par de oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO 13 y 14.
12. Kit, según la reivindicación 7, que comprende adicionalmente oligonucleótidos adecuados para la determinación del genotipo de SNP5 del gen CCNA1.
13. Kit, según la reivindicación 12, donde la determinación del genotipo de SNP5 se lleva a cabo mediante el par de oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO 15 y 16.
14. Kit según la reivindicación 7, que comprende adicionalmente oligonucleótidos adecuados para la determinación del genotipo de SNP6 del gen CDKN1A.
15. Kit, según la reivindicación 14, donde la determinación del genotipo de SNP6 se lleva a cabo mediante el par de oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO 17 y 18.
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