PROCEDIMIENTO PARA LA DISCRIMINACIÓN ENTRE METAPLASIAS Y LESIONES NEOPLÁSICAS O PRENEOPLÁSICAS.
Un procedimiento para discriminar metaplasias que sobreexpresan p16INK4a lesiones neoplásicas o preneoplásicas que sobreexpresan p16INK4a en muestras biológicas durante el curso de procedimientos de pruebas citológicas,
que comprende a. determinar la presencia o ausencia de células que sobreexpresan p16INK4a en dichas muestras biológicas; b. determinar la presencia o ausencia de células que expresan un producto génico de L1 de HPV de alto riesgo en dichas muestras biológicas; c. evaluar la presencia simultánea de células que expresan productos génicos de L1 de HPV de alto riesgo con células que sobreexpresan p16INK4a, o la presencia de células que sobreexpresan p16INK4a solo; d. en el que la presencia simultánea de células que expresan productos génicos L1 de HPV de alto riesgo con células que sobreexpresan p16INK4a es indicativa de lesiones neoplásicas o preneoplásicas
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07106444.
Solicitante: MTM LABORATORIES AG.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: IM NEUENHEIMER FELD 583 69120 HEIDELBERG ALEMANIA.
Inventor/es: MARTIN, PETER, VON KNEBEL DOEBERITZ, MAGNUS, RIDDER,RUEDIGER.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 8 de Abril de 2003.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68M6B
- G01N33/574C2
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/574 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para el cáncer.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
PDF original: ES-2360342_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para la discriminación entre metaplasias y lesiones neoplásicas o preneoplásicas.
La presente invención se refiere a un procedimiento para discriminar metaplasias que sobreexpresan p16INK4a de lesiones neoplásicas o preneoplásicas que sobreexpresan p16INK4a mediante la determinación del nivel de moléculas de L1 de alto riesgo producto génico codificadas en el HPV en muestras biológicas durante el curso de procedimientos de pruebas citológicas. Por tanto, el procedimiento permite reducir los resultados falsos positivos en la detección de lesiones anogenitales basada en p16INK4a en procedimientos de pruebas citológicas.
Se ha demostrado que la detección de sobreexpresión de p16INK4a en muestras biológicas es un marcador útil en la detección de lesiones anogenitales tales como carcinoma del cuello uterino (véase el documento WO00/01845; Klaes y col.; Int. J. Cáncer: 92, 276-284 (2001)). El procedimiento basado en la tinción inmunoquímica específica de p16INK4a permite una identificación sensible y específica de células displásicas en secciones de tejido y en muestras citológicas. En los análisis inmunohistoquímicos de tejidos, las células neoplásicas se pueden teñir usando un procedimiento de tinción mediada por anticuerpos específicos de p16INK4a. Por tanto, el diagnóstico histológico de las lesiones neoplásicas puede verse respaldado por una tinción basada en un marcador molecular característico de la transformación de las células en lesiones anogenitales. El diagnóstico, sean o no las células neoplásicas, en estos procedimientos no sólo se basa en la tinción específica de p16INK4a, sino también en la información histológica.
Esto se debe al hecho de que en aproximadamente el 30% de las muestras, las células metaplásicas muestran alguna inmunorreactividad con los anticuerpos específicos de p16INK4a y, por tanto, se tiñen en el curso de los procedimientos. No obstante, el patrón de tinción obtenido de estas células metaplásicas difiere del patrón que dan las lesiones neoplásicas. Las células metaplásicas dan lugar a un patrón de tinción parcheado o focal, mientras que las lesiones neoplásicas dan lugar a un patrón de tinción difuso. Además, las intensidades de tinción de las células metaplásicas son, predominantemente, inferiores a las de las células neoplásicas.
Los procedimientos habituales usados en las pruebas de detección selectiva para la detección precoz de neoplasias no emplean pruebas basadas en histología, sino que dependen de los procedimientos de análisis citológicos. No obstante, específicamente en casos, cuando no se dispone de información histológica sobre la arquitectura de los tejidos, como por ejemplo en exploraciones citológicas, la determinación de sobreexpresión de p16INK4a sola puede dar lugar a resultados falsos positivos. Esto se debe al hecho de que las células metaplásicas que expresan p16INK4a a niveles elevados detectables pueden no diferenciarse por medio de patrones de tinción histológica.
El porcentaje de células que muestran sobreexpresión de p16INK4a aumenta durante la aparición de displasias. Por tanto, en estadios neoplásicos o preneoplásicos, cuando en las muestras sólo está presente una población restringida de células neoplásicas o preneoplásicas, la inmunorreactividad de p16INK4a puede ser débil. Esta débil inmunorreactividad puede ser de aproximadamente el nivel producido por las células metaplásicas. En estadios posteriores de displasias, la inmunorreactividad global de p16INK4a es más fuerte y, por tanto, las lesiones neoplásicas se pueden discernir con facilidad de las metaplasias, incluso en un formato de pruebas citológicas. Esto podría conducir a casos en los que la presencia de células metaplásicas que expresan p16INK4a podrían confundirse con la presencia de células neoplásicas y, por tanto, produce un resultado falso positivo.
Especialmente en las pruebas de detección selectiva, cuando es deseable la detección de estadios precoces de neoplasias, esta condición es bastante desagradable. Esto es especialmente cierto, ya que se ha demostrado que el diagnóstico basado en p16INK4a es una herramienta valiosa en exploraciones histológicas y la aplicación en procedimientos de detección selectiva basados en pruebas citológicas podría reforzar estos procedimientos establecidos.
Para reducir los resultados falsos positivos en los formatos de pruebas citológicas y, de este modo, aumentar la fiabilidad del diagnóstico basado en p16INK4a de lesiones anogenitales sería deseable un procedimiento para discriminar las metaplasias de las lesiones neoplásicas y displásicas. El problema en la técnica atañe especialmente a los estadios precoces de las neoplasias, cuando el porcentaje de células que muestran sobreexpresión de p16INK4a todavía está a niveles que podrían confundirse con niveles de células metaplásicas normales en proliferación que sobreexpresan p16INK4a. Por tanto, medios útiles para resolver el presente problema tienen que implicar parámetros que caractericen estadios precoces de neoplasias del tracto anogenital. Ninguna característica de las displasias y/o neoplasias que aparecen durante la progresión de la tumorigénesis de modo que se demuestra que son herramientas diagnósticas para displasias de alto grado, y que están limitadas a estadios precoces de la tumorigénesis es adecuada para el procedimiento de acuerdo con la presente invención.
En las formas de realización reivindicadas de acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para la discriminación de metaplasias de lesiones neoplásicas y preneoplásicas.
Para respaldar la discriminación de metaplasias de lesiones neoplásicas en procedimientos de pruebas basados en la sobreexpresión de p16INK4a sería deseable una molécula marcadora que se exprese en células y tejidos neoplásicos y/o preneoplásicos y que no se exprese en células metaplásicas.
La E2 del HPV se expresa especialmente en las lesiones de NIC de grado bajo y la expresión disminuye al crecer los grados de la NIC (Stevenson y col., J. Gen. Viral., 81, 1825-32 (2000)). En la mayoría de los carcinomas invasivos no se puede detectar expresión de la proteína E2. Esto puede deberse al hecho de que partes del gen E2 se pierden durante la integración del ADN del HPV en el genoma del huésped. Por tanto, en infecciones por HPV persistentes con el ADN del HPV integrado no se puede detectar expresión de E2 o ésta es baja.
Debido a estos hechos, se ha probado que la proteína E2 es un marcador de estadios precoces de lesiones asociadas con infecciones por HPV de alto riesgo. En contraste con esto, p16INK4a es un marcador que está sobreexpresado incluso en los estadios precoces de las lesiones anogenitales, cuyo nivel de expresión aumenta durante la progresión de lesiones displásicas. El hecho de que la E2 se exprese especialmente en los estadios precoces de las neoplasias la convierte en particularmente útil para los procedimientos de detección precoz. El alto nivel de expresión de la proteína E2 en los estadios precoces de la infección por HPV permite identificar las células infectadas antes de que haya un número abundante de copias del virus presente en las células analizadas.
Los productos génicos L1 y L2 también son útiles para el procedimiento de acuerdo con la presente divulgación debido a su alto nivel de expresión, principalmente en los estadios precoces de la infección viral antes de que se produzca la integración. La expresión de estos productos génicos también se reduce en la infección persistente por HPV.
Actualmente, los inventores han descubierto que las células que expresan productos génicos del HPV de alto riesgo, como la E2 del HPV, pueden servir para discriminar lesiones precoces neoplásicas o displásicas detectables por tinción inmunoquímica específica de p16INK4a de metaplasias, que pueden también comprender células inmunorreactivas con p16INK4a, durante los procedimientos de pruebas citológicas.
Las células que expresan otros productos génicos codificados en el HPV que son detectables a un nivel de expresión como ARNm o polipéptido en los estadios neoplásicos o estadios preneoplásicos también pueden servir para la discriminación de lesiones neoplásicas y/o preneoplásicas de metaplasias que sobreexpresan... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para discriminar metaplasias que sobreexpresan p16INK4a lesiones neoplásicas o preneoplásicas que sobreexpresan p16INK4a en muestras biológicas durante el curso de procedimientos de pruebas citológicas, que comprende
2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el producto génico L1 de HPV es un polipéptido o una molécula de ARN.
3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las lesiones neoplásicas o preneoplásicas son lesiones del tracto anogenital.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que las lesiones del tracto anogenital son lesiones del cuello uterino.
5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las muestras biológicas son muestras que contienen células de origen anogenital.
6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que las células son células que se originan a partir del cuello uterino.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la muestra biológica es un frotis de Papanicolau o una preparación citológica del cuello uterino.
8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la detección de los productos génicos de L1 de HPV y de las moléculas de p16INK4a se realiza usando al menos una sonda específica para las moléculas que se van a detectar.
9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la sonda está marcada de forma que se puede detectar.
10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato metálico o una enzima.
11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la sonda es una proteína y/o un ácido nucleico.
12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que al menos una sonda es un anticuerpo dirigido contra un producto génico codificado de L1 de HPV de alto riesgo o p16INK4a.
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende un procedimiento de tinción inmunocitoquímica.
14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que al menos una sonda es un ácido nucleico que híbrida específicamente con un producto génico de L1 de HPV de alto riesgo.
15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende una reacción de hibridación in situ.
16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende una reacción de amplificación del ácido nucleico.
17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la reacción de amplificación del ácido nucleico es PCR o LCR.
18. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las reacciones de detección que usan ácidos nucleicos como sondas o polipéptidos como sondas se llevan a cabo simultáneamente.
19. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los productos génicos de HPV de alto riesgo son productos génicos de los subtipos de HPV asociados con cáncer, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58.
20. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se determina la sobreexpresión de p16INK4a simultánea a la expresión de al menos un producto génico de L1 de HPV de alto riesgo en al menos una única célula.
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