Un procedimiento para evaluar el diagnóstico de un tumor seleccionado del grupo que consiste en tumores del tracto anogenital,

tumores del tracto gastrointestinal, tumores del tracto respiratorio y tumores del sistema urinario a partir de muestras solubilizadas de citología en liquido (CBC) que consiste en las etapas de

a. detectar la presencia o ausencia y/o el nivel de un polipéptido marcador seleccionado del grupo de p16INK4a, claudina, Ki67, KiS1, PCNA MCM-2, MCM-5, CDC-6, Her-2/Neu, ciclina E y un polipéptido del HPV derivado de un gen del HPV seleccionado del grupo que consiste en HPV L1, HPV L2, HPV El, HPV E2, HPV E4, HPV E5, HPV E6 y HPV E7;

b. comparar la presencia o ausencia y/o el nivel de dicho polipéptido marcador con la presencia o ausencia y/o el nivel conocido como característico de una muestra corporal sana no patológica; y

c. evaluar el diagnóstico del tumor basado en la presencia o ausencia y/o el nivel de dicho polipéptido marcador en las células contenidas en la muestra de LBC comparado con una muestra corporal sana no patológica

Procedimiento para detectar afecciones de relevancia médica en una muestra de LBC solubilizada.

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar afecciones de relevancia médica en muestras de LBC solubilizadas. Dicho procedimiento no se basa en parámetros morfológicos y usa análisis bioquímicos no basados en células para determinar la presencia o ausencia y/o el nivel de molécula marcadora en la muestra de LBC solubilizada. La detección de moléculas marcadoras se lleva a cabo por detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de determinadas proteínas o fragmentos de las mismas.

Antecedente de la invención

El diagnóstico de un gran número de afecciones de relevancia médica se lleva a cabo hoy en día usando marcadores moleculares como herramientas. Las herramientas moleculares en general se usan como un aspecto en un examen complejo, que tienen en cuenta una serie de parámetros diferentes que caracterizan las muestras que se van a examinar.

En los análisis de relevancia médica es común el uso del examen morfológico de muestras por medios citológicos. Dichos procedimientos basados en la caracterización morfológica de las muestras basadas en células, se pueden aplicar, por ejemplo, en el análisis de muestras clínicas tales como fluidos corporales, sangre, resecciones quirúrgicas, secreciones, extensiones o lavados.

Las aplicaciones actuales de citología en el diagnóstico usan cada vez más procedimientos de citología en liquido (en lo sucesivo abreviado como LBC, por sus siglas en inglés liquid based cytology). Esto se debe al hecho de que la LBC puede proporcionar propiedades de la morfología mejoradas de la preparación citológica y que los contaminantes tales como, p. ej., moco o similares, se pueden eliminar por el procedimiento de LBC. Además, la LBC permite el almacenamiento de material de muestra sin procesar que después se puede someter a diferentes tipos de exámenes citológicos. En la citología convencional, el material de muestra se procesa hasta una muestra de ensayo de citología convencional. El sobrante no se podía conservar. Por lo tanto, solo se podía aplicar un análisis a las muestras convencionales.

Una aplicación importante de la LBC se refiere al amplio cribado de población para el cáncer de cuello de útero. Sin embargo, se pueden aplicar procedimientos similares para otras entidades de cáncer y las respectivas etapas precursoras tales como p. ej. cánceres del sistema urinario, del tracto respiratorio y otros.

Es una práctica habitual el uso de muestras de LBC para preparar una muestra de citología monocapa o en capa fina. Esta muestra se somete a un análisis basado en célula. En determinadas circunstancias, se aplican reacciones inmunocitoquímicas a las muestras de citología. Sin embargo, en la práctica común, las muestras de LBC se usan para el análisis basado en células de las muestras. Esto también puede verse por el hecho de que los argumentos para usar la LBC señalan las ventajas relativas a la morfología celular y la eliminación de los contaminantes.

En el cribado del cáncer de cuello de útero, por ejemplo, se usan muestras de LBC preparadas a partir de extensiones para detectar lesiones neoplásicas del cuello de útero. En el procedimiento de cribado, deben distinguirse lesiones de diferente origen. Las causas de lesiones pueden ser, por ejemplo, inflamaciones (debidas a agentes infecciosos o daño físico o químico) o cambios preneoplásicos o neoplásicos. En los exámenes morfológicos es complejo distinguir las lesiones de diferentes características. Así, para el examen de frotis convencionales, así como de muestras en capa fina preparadas a partir de muestras de LBC, los citólogos y patólogos deben estar especialmente entrenados, e incluso los analizadores con experiencia tienen una alta variación entre observadores y en un mismo observador en la evaluación de un diagnóstico basado en muestras citológicas. En general, el resultado del examen se basa en la interpretación subjetiva de los criterios de diagnóstico del patólogo/citólogo que lo examina. Como resultado, la tasa de resultados positivos falsos y negativos falsos en los ensayos de cribado sigue siendo muy insatisfactoria.

Por lo tanto, en muchos casos estos procedimientos de examen citológico se respaldan mediante el uso de marcadores moleculares. Dichos marcadores se usan a menudo en reacciones de tinción inmunocitoquímica, o en el curso de reacciones de hibridación in situ. En las combinaciones de la técnica anterior de exámenes morfológicos y reacciones de tinción inmunocitoquímica basadas en moléculas marcadores, las características de diferentes estados de relevancia médica de tejidos o células, pueden conducir a resultados mejorados. El examen morfológico sigue siendo laborioso y requiere tiempo y por lo tanto es caro, incluso cuando está respaldado por los procedimientos moleculares, que hacen que los resultados sean más fiables. P. ej., el documento WO0208764 describe la detección basada en proteínas y péptidos de moléculas marcadoras tales como HPV E4, la proteína MCM, y otras en aplicaciones basadas en células incluyendo preparaciones histológicas y citológicas. Para reducir el coste de los programas de diagnóstico que usan exámenes citológicos, debería realizarse una preselección de las muestras que se van a examinar por procedimientos citológicos. Esto bajaría el coste y reduciría la sobrecarga del examen citológico y así contribuiría a la precisión del diagnóstico basado en citología.

En la técnica describen procedimientos para detectar el cáncer de cuello de útero, basados en muestras cervicouterinas solubilizadas, Brule, van den, y col.; J. Clin. Microbiol:, Vol 28/12, 1990, páginas 2739-2743, WO03/057914 y el documento WO99/29890. Brule y col. describen un procedimiento para la detección basada en la PCR de ácidos nucleicos del HPV en raspados cervicouterinos. El documento WO99/29890 describe un procedimiento para detectar el ARNm del HPV en muestras cervicouterinas y describe la posibilidad de usar muestras de LBC como un punto de partida para dichos exámenes. El documento WO03/057914 también describe un procedimiento basado en ARNm para detectar ácidos nucleicos del HPV en muestras cervicouterinas. Todos los documentos describen el uso de los procedimientos en el curso del diagnóstico del cáncer de cuello de útero. Sin embargo, los tres documentos usan la detección basada en ácidos nucleicos de los productos de expresión del HPV como marcador molecular y no indican ningún uso de moléculas marcadoras péptidos o proteínas en procedimientos de detección similares.

Un procedimiento para detectar los ácidos nucleicos del HPV de muestras de LBC se describe en el documento WO99/29890 de Digene Corp. Este procedimiento usa muestras de LBC como base para el análisis. La detección de ácidos nucleicos del HPV se lleva a cabo después de la lisis de las células contenidas en las muestras de LBC. En este procedimiento, no se lleva a cabo la normalización de la cantidad de la muestra de LBC que se va a usar en la detección bioquímica no basada en célula del ácido nucleico del HPV, con respecto a la información obtenida de la muestra citológica preparada a partir de la misma muestra de LBC. Por lo tanto, el procedimiento descrito por Digene está restringido a simples mediciones cualitativas. Cualquier procedimiento cuantitativo o incluso semicuantitativo bioquímico no basado en células, necesita información sobre la composición de las muestras, que se puede obtener de los marcadores bioquímicos o del análisis microscópico o de citometría de flujo de la muestra.

En el documento EP1388734 se describe un procedimiento no basado en células para detectar enfermedades. Este procedimiento usa una etapa de normalización basada en una molécula marcadora de normalización para sustituir la información que se podría obtener de las muestras citológicas y por lo tanto permitir la evaluación del diagnóstico. Por lo tanto, este procedimiento se basa en la detección simultánea de una molécula marcadora para una enfermedad, junto con un marcador de normalización de cada muestra. En este documento no se sugiere un procedimiento de evaluación de enfermedades a partir de muestras corporales solubilizadas basado solo en marcadores de la enfermedad, sin normalización respecto a un segundo marcador bioquímico.

En la presente invención, el uso de muestras de LBC para evaluar el diagnóstico, permite una forma precisa y comparable de proporcionar información citológica para el ensayo bioquímico no basado en células. El uso de...

1. Un procedimiento para evaluar el diagnóstico de un tumor seleccionado del grupo que consiste en tumores del tracto anogenital, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del tracto respiratorio y tumores del sistema urinario a partir de muestras solubilizadas de citología en liquido (CBC) que consiste en las etapas de

a. detectar la presencia o ausencia y/o el nivel de un polipéptido marcador seleccionado del grupo de p16^INK4a, claudina, Ki67, KiS1, PCNA MCM-2, MCM-5, CDC-6, Her-2/Neu, ciclina E y un polipéptido del HPV derivado de un gen del HPV seleccionado del grupo que consiste en HPV L1, HPV L2, HPV El, HPV E2, HPV E4, HPV E5, HPV E6 y HPV E7;

b. comparar la presencia o ausencia y/o el nivel de dicho polipéptido marcador con la presencia o ausencia y/o el nivel conocido como característico de una muestra corporal sana no patológica; y

c. evaluar el diagnóstico del tumor basado en la presencia o ausencia y/o el nivel de dicho polipéptido marcador en las células contenidas en la muestra de LBC comparado con una muestra corporal sana no patológica.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tumor del tracto anogenital es cáncer de cuello de útero, neoplasia intraepitelial cervicouterina o carcinoma de cuello de útero in situ.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tumor del tracto gastrointestinal es cáncer de colon, cáncer del duodeno, cáncer pancreático, cáncer esofágico, cáncer de hígado, cáncer del sistema biliar o cáncer del ano o recto.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tumor del tracto respiratorio es cáncer de pulmón, cáncer de los alveolos, cáncer del árbol bronquial, cáncer del espacio nasofaríngeo, cáncer de la cavidad oral, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón adenoescamoso, mesotelioma, tumor carcinoide del pulmón o tumor de las glándulas bronquiales.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tumor del sistema urinario es cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de pelvis renal, cáncer de los uréteres o cáncer de la uretra.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la detección de un polipéptido marcador se lleva a cabo usando al menos un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o minianticuerpo, específico de dicho polipéptido marcador que se va a detectar.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o minianticuerpo está marcado de forma detectable.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto electroluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato de metal, una enzima o una estructura de unión biológicamente relevante.