Un procedimiento de estimación del estado de MSI de afecciones médicamente relevantes asociadas a MSI que comprende determinar la presencia o ausencia de mutaciones en la repetición T-25 localizada en la 3''-UTR del gen CASP2 y estimar el estado de MSI a partir de dicha presencia o ausencia de mutaciones en la T-25 localizada en la 3''-UTR del gen CASP2,

en el que la presencia de mutaciones es indicativa de la presencia de un estado de MSI-H

Compuestos y procedimientos para la estimación del estado de inestabilidad de microsatélites (MSI).

La presente invención proporciona un procedimiento para la estimación del estado de inestabilidad de microsatélites (MSI en inglés) de afecciones médicamente relevantes asociadas al fenotipo de MSI tales como, por ejemplo, lesiones neoplásicas. El procedimiento está basado en el análisis de una repetición mononucleotídica monomórfica en la 3'-UTR del gen de caspasa 2 (CASP2). Basándose en la determinación de la longitud de la repetición mononucleotídica citada, puede estimarse la presencia o ausencia de MSI. La determinación de la longitud se efectúa en un solo procedimiento de PCR. Como alternativa, puede efectuarse una estimación potenciada combinando el marcador CASP2 con marcadores adicionales tales como BAT25 y BAT26 en un solo proceso de PCR múltiple.

Antecedentes de la invención

Se observa un sistema de reparación de errores de apareamiento de ADN (MMR en inglés) deficiente en aproximadamente un 10-15% de todos los carcinomas colorrectales y en hasta un 90% de los pacientes de cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC en inglés). Los tumores con defectos del MMR adquieren mutaciones en tramos de ADN repetitivos cortos, un fenómeno denominado inestabilidad de microsatélites. La determinación del estado de los microsatélites en cáncer de colon es de relevancia creciente puesto que (1) el estado de los microsatélites es un factor de pronóstico independiente en cáncer colorrectal, (2) la eficacia de la quimioterapia coadyuvante parece depender del estado de los microsatélites del tumor, y (3) la inestabilidad de los microsatélites es la herramienta de selección molecular más importante para la identificación de pacientes de HNPCC y familias afectadas por mutaciones de linea germinal en genes de MMR. Por lo tanto, el ensayo rutinario del MSI parece estar justificado para todos los casos de cáncer colorrectal.

La inestabilidad de microsatélites se observa en aproximadamente un 10-15% de los carcinomas colorrectales esporádicos (CRC en inglés) y hasta en un 90% de los pacientes de cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) que albergan mutaciones de linea germinal en genes de reparación de errores de apareamiento de ADN (MMR) (para una revisión, véase Lynch y de la Chapelle "Microsatellite instability", N. Engl. J. Med. 17 de julio de 2003; 349(3): 247-57). Los CRC que exhiben el fenotipo de inestabilidad de microsatélites (MSI) poseen rasgos patológicos y clínicos particulares. Los CRC con MSI-H están a menudo localizados en el colon proximal y presentes con una densa infiltración de linfocitos intratumorales (Smyrk y col. "Tumor-infiltrating lymphocytes are a marker for microsatellite instability in colorectal carcinoma", Cancer, 15 de junio de 2001; 91(12): 2417-22; Dolcetti y col. "High prevalence of activated intraepithelial cytotoxic T lymphocytes and increased neoplastic cell apoptosis in colorectal carcinomas with microsatellite instability", Am. J. Pathol., junio de 1999; 154(6): 1805-13). Varios estudios reseñan un mejor pronóstico para pacientes de CRC con MSI-H (Gryfe y col. "Tumor microsatellite instability and clinical outcome in young patients with colorectal cancer", N. Engl. J. Med., 13 de enero de 2000; 342(2): 69-77; Wright y col. "Prognostic significance of extensive microsatellite instability in sporadic clinicopathological stage C colorectal cancer", Br. J. Surg., septiembre de 2000; 87(9): 1197-202); Samowitz y col. "Microsatellite instability in sporadic colon cancer is associated with an improved prognosis at the population level", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., septiembre de 2001; 10(9): 912-23). De forma interesante, la sensibilidad a la quimioterapia parece depender del estado de los microsatélites de células de tumor colorrectal (Claij, "Microsatellite instability in human cancer: a prognostic marker for chemotherapy?", Exp. Cell. Res. 10 de enero de 1999; 246(1): 1-10); Hemminki y col. "Microsatellite instability is a favorable prognostic indicator in patients with colorectal cancer receiving chemotherapy", Gastroenterology, octubre de 2000; 119(4): 921-8; Watanabe y col. "A change in microsatellite instability caused by cisplatin-based chemotherapy of ovarian cancer", Br. J. Cancer, 28 de septiembre de 2001; 85(7): 1064-9). El sistema de MMR de ADN parece estar implicado en la inducción de la apoptosis mediante agentes dañinos para el ADN, in vitro, varias lineas celulares con un sistema de reparación de errores de apareamiento defectivo han mostrado ser resistentes a dichos agentes (Claij "Microsatellite instability in human cancer: a prognostic marker for chemotherapy?", Exp. Cell. Res., 10 de enero de 1999; 246(1): 1-10; Bawa y Xiao "A mutation in the MSH5 gene results in alkylation tolerante", Cancer Res. 1 de julio de 1997;. 57(13): 2715-20; Carethers y col. "Mismatch repair proficiency and in vitro response to 5-fluorouracil", Gastroenterology, julio de 1999, 117(1): 123-31). En un estudio de Ribic y col. ("Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer", N. Engl. J. Med., 17 de julio de 2003; 349(3): 247-57), se observó una tendencia hacia una supervivencia global más corta en pacientes tratados con quimioterapia de 5-fluorouracilo (5-FU) de CRC con MSI-H, mientras que los pacientes de CRC con MSS se beneficiaban de la terapia con 5-FU coadyuvante. En un estudio diferente, la supervivencia mejorada de pacientes de CRC tratados con quimioterapia se limitó a los casos de MSS, mientras que no se detectó efecto en el grupo de MSI-H (Carethers y col. "Use of 5-fluorouracil and survival in patients with microsatellite-unstable colorectal cancer", Gastroenterology, febrero de 2004; 126(2): 688-9).

Estos datos apuntan a la importancia clínica del estado de los microsatélites en CRC y proporcionan buenas razones para un ensayo de MSI rutinario de todos los casos de cáncer colorrectal. Sin embargo, el procedimiento estándar actual es largo, laborioso y caro.

Actualmente, el ensayo de MSI se aplica habitualmente sólo a pacientes preseleccionados según criterios clínicos (Directrices de Bethesda, Boland y col. "A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer", Cancer Res., 15 de noviembre de 1998; 58(22): 5248-57), debido a que el procedimiento de ensayo estándar recomendado por el seminario de ICG-HNPCC (Boland y col. "A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer", Cancer Res., 15 de noviembre de 1998, 15; 58(22): 5248-57) implica una carga de trabajo de laboratorio considerable: tienen que amplificarse a partir del ADN de tejido tumoral y normal cinco marcadores de microsatélite incluyendo dos repeticiones mononucleotídicas (BAT26 y BAT25) y tres repeticiones dinucleotídicas (D2S123, D5S346, D17S250). Se usa un panel de cinco marcadores de MSI adicionales para la clasificación de MSI de los casos limite. Estos numerosos marcadores que requieren análisis del ADN normal apareado del mismo paciente hacen al análisis de MSI un procedimiento de ensayo laborioso y costoso que no es aplicable para selección de alto rendimiento.

Por lo tanto, se requiere una estrategia de ensayo simplificada para ensayos de alto rendimiento. Para reducir la carga de trabajo del ensayo de MSI, se han sugerido varias técnicas en publicaciones anteriores. La inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales específicos de MLH1 y MSH2 se acepta normalmente como una herramienta útil para identificar a tumores relacionados con HNPCC (Marcus y col. 1999 "Immunohistochemistry for hMLH1 and hMSH2: a practical test for DNA mismatch repair-deficient tumors", Am. J. Surg. Pathol., octubre de 1999; 23(10): 1248-55'', Lindor y col. "Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing in phenotyping colorectal tumors", J. Clin. Oncol., 15 de febrero de 2002; 20(4): 897-9; Umar y col. "Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability", J. Natl. Cancer Inst., 18 de febrero de 2004; 96(4): 261-8) y la sensibilidad puede potenciarse adicionalmente mediante la inclusión de anticuerpos adicionales que reconocen MSH6 y PMS2. En comparación con el ensayo...

1. Un procedimiento de estimación del estado de MSI de afecciones médicamente relevantes asociadas a MSI que comprende determinar la presencia o ausencia de mutaciones en la repetición T-25 localizada en la 3'-UTR del gen CASP2 y estimar el estado de MSI a partir de dicha presencia o ausencia de mutaciones en la T-25 localizada en la 3'-UTR del gen CASP2, en el que la presencia de mutaciones es indicativa de la presencia de un estado de MSI-H.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la afección médicamente relevante es un tumor.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el tumor se selecciona de un grupo que comprende tumores del tracto anogenital, tumores del tracto colorrectal, carcinoma colorrectal, adenoma colorrectal, pólipos colorrectales, tumores del tracto gastrointestinal, carcinoma del intestino delgado, pólipos del intestino delgado, tumores de los conductos biliares, carcinoma pancreático, tumores del tracto respiratorio, tumores endometriales, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, tumores del sistema nervioso central, glioblastoma multiforme, meduloblastoma, tumores de próstata, tumores de mama y carcinoma de mama.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la determinación de la presencia o ausencia de mutaciones en la repetición T-25 localizada en la 3'-UTR del gen CASP2 se lleva a cabo usando sondas o cebadores de ácidos nucleicos como agentes de unión para la reacción de detección.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de detección se lleva a cabo usando una reacción de hibridación de ácido nucleico o una reacción de amplificación de ácido nucleico.

6. Un kit para efectuar un procedimiento de estimación del estado de MSI de afecciones médicamente relevantes asociadas a MSI, que comprende al menos un par de cebadores que permiten la amplificación de un ácido nucleico que comprende la repetición T-25 localizada en la 3'-UTR del gen CASP2, seleccionados de un grupo constituido por los pares de cebadores

7. Un procedimiento informatizado para crear una estrategia para la terapia de afecciones médicamente relevantes asociadas a MSI que comprende i) comparar los datos que representan la presencia o ausencia de mutaciones en la repetición T-25 localizada en la 3'-UTR del gen CASP2 con datos clínicos que comprenden información sobre la presencia o ausencia de mutaciones en dicha repetición T-25 e información sobre el curso de la enfermedad de los pacientes y el resultado mediante un medio de comparación; ii) crear subgrupos de datos que representan individuos según la presencia o ausencia de mutaciones y suministrar los subgrupos a un medio de valoración; y iii) estimar la comparación basada en los subgrupos de datos mediante el medio de valoración y suministrar la valoración del medio de valoración a un medio de ajuste de terapia, ajustando el medio de ajuste de terapia la terapia adecuada para individuos según la estimación.

8. Un par de cebadores de ácido nucleico complementarios y complementarios inversos del gen CASP2 que se diseñan para permitir la amplificación de un ácido nucleico de 50 a 500 nt de longitud que comprende la repetición T-25 localizada en la 3'-UTR del gen CASP2 para uso en un procedimiento de estimación del estado de MSI de afecciones médicamente relevante asociadas a MSI según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.