SE PRESENTAN ANTICUERPOS AGONISTAS QUE SE ENLAZAN A LA REGION EXTRACELULAR DE LAS CINASAS DE TIROSINA DE PROTEINAS RECEPTORAS PTKS,

Y CAUSAN ASI LA DIMERIZACION Y ACTIVACION DE LA REGION DE CINASA DE TIROSINA INTRACELULAR DE LAS MISMAS. LOS ANTICUERPOS SON UTILES PARA ACTIVAR SU RECEPTOR CORRESPONDIENTE Y PERMITEN ESTUDIAR ASI EL PAPEL DEL RECEPTOR DE LA CINASA DE TIROSINA EN EL CRECIMIENTO Y/O DIFERENCIACION CELULAR. TAMBIEN SE PRESENTAN PROTEINAS QUIMERICAS QUE CONTIENE LA REGION EXTRACELULAR DE LAS PTKS RECEPTORAS Y UNA SECUENCIA DE REGION CONSTANTE DE INMUNOGLOBULINA

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a quimeras pTK-inmunoglobulina.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR 5

La transducción de señales que regulan el crecimiento y diferenciación celular está regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosina quinasa son enzimas que catalizan este proceso. Además, muchas actúan como receptores de factores de crecimiento. El subgrupo c-kit de receptores de tirosina quinasa catalizan la fosforilación de sustratos exógenos, así como residuos de tirosina en sus propias cadenas de polipéptidos (Ullrich et al., Cell 61:203 [1990]). Los miembros del subgrupo c-kit incluyen FLT/FLK (Kinasa de hígado 10 fetal), FGF (Receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos) y NGF (Receptor del Factor de Crecimiento Nervioso)

La subfamilia EPH de tirosina quinasa, Eph, Elk, Eck, Eek, Hek, Hek2, Sek, Ehk-1, Ehk-2, Cek-4 to -10, Tyro 1, 4, 5 y 6, parece ser la subfamilia más grande de tirosinas quinasas transmembrana (Hirai et al., Science 238:1717-1720 [1987]; Letwin et al., Oncogene 3:621-678 [1988]; Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 13:7071-7079 [1993]; 15 Lindberg et al., Mol. cell. Biol. 10:6316-6324 [1990]; Bohme et al., Oncogene 8:2857-2862 [1993]; y Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:1611-1615 [1992]; Pasquale et al. Cell Regulation 2:523-534 [1991]; Sajjadi et al., New Biol. 3:769-778 [1991] ; Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:1611-1615 [1992]; Lhotak et al., Mol. Cell. Bio. 11:2496-2502 [1991]; Gilardi-Hebenstreit et al., Oncogene 7:2499-2506 [1992]; Lai et al., Neuron 6:691-704 [1991]; Sajjadi et al., Oncogene 8:1807-1813 [1993]; and Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277-3288 [1993]). 20

Las pTK adicionales y anticuerpos agonistas a las mismas son necesarias para estudiar adicionalmente el crecimiento y diferenciación de las células, para su uso como agentes terapéuticos y para fines de diagnóstico.

Ashman et al. (Journal of Cellular Physiology 158: 545-554; 1994) describe tres anticuerpos monoclonales al receptor tirosina quinasa c-kit humano.

WO 93/15201 A (New England Deaconess Hospital) describe información de la secuencia para las proteínas 25 tirosina quinasa HpTK5, SAL-S1 y bpTK7, y propone el uso de las proteínas en ensayos para ligandos, tales como factores de crecimiento o factores de diferenciación que inhiben o aumentan la actividad quinasa y como inmunógenos para producir anticuerpos monoclonales o policlonales.

Mark et al. (The Journal of Biological Chemistry 267: 26166-26171; 1992) describe que el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFr) es un receptor pTK y describe una proteína de fusión HGFr-IgG. 30

La presente invención proporciona anticuerpos agonistas que se unen al dominio extracelular del dominio quinasa de un receptor de proteína tirosina quinasa (pTK) seleccionado del grupo que consiste en:

a) SAL-S1;

b) HpTK 5; y

c) bpTK 7. 35

y lo activan

La presente invención también proporciona métodos de utilización de los mismos, quimeras del receptor bpTK7 y métodos para producir las quimeras.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

Los genes aislados tal como se describen en la presente invención son referidos, colectivamente, como 40 “genes de proteína tirosina quinasa” o “genes de pTK”. Las secuencias de ácidos nucleicos de algunos de estos genes, aislados tal como se describe aquí, muestran una homología significativa con proteínas tirosina quinasas identificadas previamente que contienen dominios extracelulares, que actúan como receptores de factores de crecimiento (por ejemplo, pTKs del subgrupo c-kit). Se ha observado que algunos de los genes de pTK están presentes tanto en células megacariocíticas como células linfocíticas. 45

En particular, se han identificado catorce genes de pTK. Se identificaron dos genes de pTK, referidos como SAL-S1 y SAL-D4, en células megacariocíticas. SAL-D4 está relacionado con la familia CSK de pTK intracelulares y SAL-S1 está relacionado con la familia de receptores FGF de pTK. Se identificaron cinco genes de pTK, referidos como LpTK, en células linfocíticas y se ha observado que están presentes también en megacariocitos. Se identificó un gen de pTK, referido como HpTK5, en células de hematoma humano. Se hallaron seis genes de pTK, referidos 50

como genes de bpTK, en tejido de cerebro humano.

Los genes de pTK se identificaron en general utilizando dos grupos de cebadores de oligonucleótidos degenerados: un primer grupo que amplifica todos los segmentos de ADN de pTK (SEC ID NOS: 1-2), y un segundo grupo que amplifica secuencias altamente conservadas presentes en el dominio catalítico del subgrupo c-kit de pTKs (SEC ID NOS: 3-4). Los genes de pTK identificados de esta manera se describen a continuación. 5

SAL-S1 se expresa en varias líneas de células megacariocíticas, pero no en líneas de células eritroides. Se obtuvo la secuencia de nucleótidos de parte de SAL-S1, revelando una secuencia que contenía 160 pares de bases (SEC ID NO: 5). Este fragmento de ADN aislado codificaba una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 6) que mostraba una homología de secuencia significativa con proteínas tirosina quinasas conocidas de la familia FLT/FLK. La secuencia de aminoácidos deducida de SAL-S1 (SEC ID NO: 33) contiene 1298 residuos. 10

SAL-D4, también expresado en células megacariocíticas, es un fragmento de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de 147 pares de bases. (SEC ID NO: 7). Este fragmento de ADN aislado codificaba una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 8) que mostraba una homología de secuencia significativa con proteínas tirosina quinasas conocidas de la familia de pTK intracelulares CSK.

Las LpTKs, incluyendo LpTK 2, LpTK 3, LpTK 4, LpTK 13 y LpTK 25, se expresan en células linfocíticas, así 15 como células megacariocíticas. Se obtuvo la secuencia de nucleótidos (151 pares de bases) del gen de LpTK 3 (SEC ID NO: 11). Las secuencia de nucleótidos de los genes de LpTK 2, LpTK 4, y LpTK 13 contenían 149 pares de bases (SEC ID NO: 9), 137 pares de bases (SEC ID NO: 13), y 211 pares de bases (SEC ID NO: 15) respectivamente. La LpTK 25 tiene una secuencia de nucleótidos de 3120 b.p. (SEC ID NO: 22). Se ha obtenido una secuencia de genes de longitud completa para LpTK 2 (SEC ID NO: 19) que contiene 7607 b.p. La secuenciación 20 adicional de LpTK 4 reveló una secuencia de 404 b.p. (SEC ID NO: 21).

El gen de HpTK5, expresado en células de hematoma humano, presenta una secuencia de nucleótidos de 3969 b.p. (SEC ID NO: 23).

Las secuencias de nucleótidos de las bpTKs, incluyendo bpTK 1, bpTK 2, bpTK 3, bpTK 4, bpTK 5 y bpTK 7, se expresan en tejido de cerebro humano y codifican proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos de SEC 25 ID NOS: 25-30 y 36, respectivamente.

De este modo, se puede aislar el ADN de una línea de células megacariocíticas humanas, que se hibrida al ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que es altamente conservada en el dominio catalítico de proteínas tirosina quinasas del subgrupo c-kit.

Las proteínas codificadas por los genes de pTK identificadas tal como se describe en la presente invención 30 muestran una homología de secuencia significativa con los miembros del subgrupo c-kit de pTKs, así como las proteínas codificadas por HpTK5 y las bpTKs. Son posibles homólogos o equivalentes de SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK5 y bpTK (es decir, proteínas que tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente similares, pero no idénticas, a las de SAL-S1, SAL-D4, las LpTKs, HpTK5 y las bpTKs, que muestran actividad tirosina quinasa). Los péptidos (fragmentos de SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK5 y bpTK) que mantienen la actividad tirosina quinasa, 35 aunque son menos que las secuencias completas de SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK5 y bpTK también son posibles; y se pueden prever usos para las secuencias de ácidos nucleicos de SAL-S1, SAL-D4, las LpTK, HpTK y las bpTK y equivalentes de SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK y bpTK.

Las secuencias de ácidos nucleicos se pueden hibridar con ADN o ARN que codifican las proteínas descritas en la presente invención y pueden mostrar una homología de secuencia significativa con FLT/FLK, el receptor de 40 FGF o la familia de receptores NGF de proteínas tirosina... [Seguir leyendo]

1. Proteína quimérica que comprende una fusión del dominio extracelular de bpTK7 con una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina.

2. Proteína quimérica según la reivindicación 1, donde la secuencia de dominio constante de inmunoglobulina es la de una inmunoglobulina IgG.

3. Ácido nucleico que codifica la proteína quimérica según la reivindicación 1. 5

4. Vector replicable que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 3.

5. Célula huésped recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 3.

6. Método de utilización de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que comprende una fusión del dominio extracelular de bpTK7, con una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, para realizar la producción de la proteína quimérica que comprende cultivar la célula huésped 10 según la reivindicación 5.

7. Utilización de la proteína quimérica según la reivindicación 1 en la producción de un anticuerpo que se une al dominio extracelular de bpTK7.