Un anticuerpo Fv monocatenario que comprende una región de fijación de antígeno capaz de fijar una porción extracelular de una glicoproteína P,

en donde el anticuerpo Fv monocatenario es capaz de inhibir al menos parcialmente la actividad de eflujo de fármaco en células multifarmaco-resistentes y en donde dicha región de fijación de antígeno está codificada por una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 2

CAMPO .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se refiere a un fragmento de anticuerpo capaz de fijarse a la glicoproteína P asociada con células multifarmaco-resistentes (MDR). La presente descripción se refiere también a composiciones y métodos que utilizan dicho fragmento de anticuerpo para inhibir la actividad de eflujo de fármaco en las células MDR del cáncer.

La quimioterapia del cáncer falla a menudo debido al desarrollo de resistencia adquirida o intrínseca en las células cancerosas a una gran diversidad de fármacos anticáncer, tales como colchicina, vinblastina, vincristina y doxorrubicina. Este fenómeno, que se conoce como multirresistencia (MDR), es una barrera importante para la quimioterapia del cáncer.

Un mecanismo fundamental de la MDR es la sobreexpresión de una bomba de eflujo dependiente de energía, conocida como el transportador de multifármacos. Esta bomba de eflujo es una glicoproteína P (Pgp) de 170 kDa, codificada por el gen MDR1. La MDR mediada por Pgp juega un papel importante en la resistencia de diversas células tumorales a la quimioterapia; estudios realizados han demostrado una correlación clara entre la expresión de mdr1 y la falta de respuesta a la quimioterapia (6, 7).

Los inhibidores del fenotipo MDR en las células del cáncer pueden modificar o alterar la expresión de la función de eflujo de fármaco de las proteínas transportadoras implicadas en la MDR. Los inhibidores conocidos de la MDR incluyen verapamil (un bloqueador de los canales de calcio y que se utiliza para el tratamiento de la leucemia), ciclosporinas, esteroides, e inhibidores de calmodulina (que aumentan la acumulación intracelular y la acción citotóxica de los fármacos transportados por Pgp). Sin embargo, la mayoría de los fármacos moduladores de la MDR conocidos disponibles actualmente para aplicación clínica tienen importantes efectos secundarios que limitan sustancialmente su valor terapéutico.

Recientemente, se han desarrollado anticuerpos monoclonales (Mab) específicos de Pgp como posibles agentes para uso en la inhibición de la MDR. La Patente U.S. No. 4.837.306 describe anticuerpos dirigidos contra la porción C-terminal del dominio intracelular de Pgp. Estos anticuerpos no tienen un efecto inhibidor conocido sobre la actividad de eflujo de fármaco en las células MDR.

Norris Murray D et al (International Journal of Cancer, vol. 65, No 5, 1996, páginas 613-619) se refieren a la implicación de la glicoproteína P MDR1 en la resistencia multifactorial al metotrexato.

La Patente U.S. No. 5.766.946 describe un anticuerpo monoclonal denominado MM.17 que reconoce un epítope localizado en el cuarto bucle extracelular de la Pgp humana. El anticuerpo MM.17 se generó por inmunización de ratones con una variante MDR de un linfoblastoide T humano. No se sabe que este anticuerpo tenga un efecto inhibidor sobre la actividad de eflujo de fármaco en las células MDR.

La Patente U.S. No. 6.479.639 describe un anticuerpo monoclonal denominado UIC2 dirigido contra un dominio extracelular de Pgp. El anticuerpo UIC2 se generó por inmunización de ratones con células fibroblastos transfectadas que expresaban Pgp. Se encontró que el Mab UIC2 era capaz de inhibir la actividad de eflujo de fármaco de las células MDR in vitro.

Los anticuerpos monoclonales denominados HYB-241 y HYB-612 reconocen un epítope externo de Pgp. Se ha informado que estos Mabs aumentan la acumulación de los fármacos quimioterapéuticos vincristina y actinomicina D en las células tumorales, aumentando de este modo la citotoxicidad [Meyers, M. B. et al., Cancer Res., 49:3209 (1987); O'Brien, J. P. et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 30:Abs 2114 (1989)].

Se ha informado que el anticuerpo monoclonal Mab657 reacciona con las células MDR [Cinciarelli, C., et al., Int. J. Cancer, 47:533 (1991)]. Se informó que este anticuerpo aumenta la sensibilidad de las células MDR a la citotoxicidad mediada por los linfocitos de la sangre periférica humana, y no se sabe que tenga un efecto inhibidor sobre la actividad de eflujo de fármaco de Pgp.

Se generaron los anticuerpos monoclonales MRK-16 y MRK-17 por inmunización de ratones con células MDR de leucemia humana. Ambos anticuerpos reconocen Pgp y son capaces de modular la actividad de eflujo de fármaco en las células MDR in vitro e in vivo[Hamada H., et al., Cancer Res. PNAS 83:7785 (1986); Pearson, J.W., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88:1386 (1991); Tsuruo, T., et. al., Jpn. J. Cancer Res. 80:627 (1989)]. Se informó que un anticuerpo quimérico recombinante que combina la región variable de MRK-16 con la porción Fc de anticuerpos humanos era más efectivo que el Mab MRK-16 parental en lo referente al aumento de la citotoxicidad para las células MDR in vitro [Hamada H. et al., Cancer Res. 50:3167 (1990)].

Una limitación sustancial de los anticuerpos arriba descritos se debe al gran tamaño de estas moléculas. Es bien sabido que la eficiencia de suministro de un agente es por regla general inversamente proporcional a su tamaño. Así, las moléculas de anticuerpos grandes arriba descritas no penetrarían y se distribuirían eficientemente en el tejido tumoral, requiriendo altas dosis de administración para alcanzar un efecto terapéutico.

Otro inconveniente importante de los anticuerpos específicos de Pgp disponibles actualmente es el hecho de que Pgp se expresa constitutivamente en los tejidos humanos normales, con inclusión de riñón, hígado, colon, testículos, linfocitos, y la barrera hematoencefálica (27). Una molécula de anticuerpo de gran tamaño podría circular típicamente durante periodos de tiempo prolongados y se aclararía lentamente de la circulación, dando como resultado posibles efectos tóxicos en los tejidos normales que expresan Pgp fisiológicamente.

Además, la mayoría de los anticuerpos específicos de Pgp arriba descritos se seleccionaron para afinidad alta a Pgp. Sin embargo, el uso práctico de anticuerpos específicos de Pgp en terapia puede verse restringido sustancialmente cuando la afinidad de fijación al anticuerpo a Pgp es alta. Esto es debido a efectos tóxicos que podrían ejercerse en los tejidos normales que expresan fisiológicamente Pgp.

Existe por tanto una necesidad generalmente reconocida de, y sería sumamente ventajoso disponer de, un anticuerpo específico de Pgp desprovisto de las limitaciones anteriores.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monocatenario Fv que comprende una región de fijación de antígeno capaz de fijar una porción extracelular de una glicoproteína P, en donde el anticuerpo monocatenario Fv es capaz de inhibir al menos parcialmente la actividad de eflujo de fármaco en las células multifarmaco-resistentes, y en donde dicha región de fijación de antígeno está codificada por una secuencia de ácido nucleico tal como se indica por SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende, como ingrediente activo, un anticuerpo monocatenario Fv que incluye una región de fijación de antígeno capaz de fijar una porción extracelular de una glicoproteína P, en donde el fragmento de anticuerpo es capaz de inhibir al menos parcialmente la actividad de eflujo de fármaco en las células multifarmaco-resistentes y en donde dicha región de fijación de antígeno está codificada por una secuencia de ácido nucleico como se indica por SEQ ID NO: 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de dicha composición farmacéutica para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en el individuo.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un kit para diagnosticar células que sobreexpresan glicoproteína P, que comprende un anticuerpo monocatenario Fv que contiene una región de fijación de antígeno capaz de fijar dicha glicoproteína P y en donde dicha región de fijación de antígeno está codificada por una secuencia de ácido nucleico como se indica por SEQ ID NO: 2; y reactivos para detectar dicho fragmento de anticuerpo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método in vitro de detección de células que sobreexpresan glicoproteína P que comprende: (a) exponer las células a un anticuerpo monocatenario... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo Fv monocatenario que comprende una región de fijación de antígeno capaz de fijar una porción extracelular de una glicoproteína P, en donde el anticuerpo Fv monocatenario es capaz de inhibir al menos parcialmente la actividad de eflujo de fármaco en células multifarmaco-resistentes y en donde dicha región de fijación de antígeno está codificada por una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 2.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dichas células multifarmaco-resistentes son células de cáncer.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde dichas células de cáncer son células de cáncer humanas.

4. Una composición farmacéutica, que comprende, como ingrediente activo, el anticuerpo Fv monocatenario de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un fármaco quimioterapéutico.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en donde dicho fármaco quimioterapéutico es tóxico para las células del cáncer.

7. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 5 ó 6 para la fabricación de un medicamento para tratamiento del cáncer en un individuo.

8. Un kit para diagnóstico de células que sobreexpresan glicoproteína P, que comprende el anticuerpo Fv monocatenario de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y reactivos para detectar dicho anticuerpo.

9. El kit de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente material de empaquetado que identifica dicho anticuerpo Fv monocatenario para uso en el diagnóstico de células que sobreexpresan glicoproteína P extracelular.

10. Un método in vitro de detección de células que sobreexpresan glicoproteína P, que comprende:

(a) exponer las células al anticuerpo monocatenario de cualquiera de las reivindicaciones 1-3; y

(b) detectar dicho anticuerpo Fv monocatenario fijado a dicha porción extracelular de dicha glicoproteína P, identificando con ello las células que sobreexpresan glicoproteína P extracelular.

11. El método de la reivindicación 10, en donde dichas células son de una muestra biológica de un individuo. 12. El kit de la reivindicación 8 ó 9, o el método de la reivindicación 10 ó 11, en donde dicho anticuerpo Fv monocatenario está marcado con un resto detectable.

13. El kit o el método de la reivindicación 12, en donde dicho resto detectable se selecciona del grupo constituido por un resto cromógeno, un resto fluorógeno, un resto fotoemisor y un resto radiactivo.

14. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 2. 15. Un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la reivindicación 14 y un promotor para regulación de la expresión de dicho polinucleótido.

16. Una célula que comprende el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 15.