ANTICUERPO QUE TIENE UNA ESPECIFICIDAD TIPO RECEPTOR DE CELULAS T, CON UNA AFINIDAD AUN MAYOR Y EL USO DEL MISMO EN LA DETECCION Y TRATAMIENTO DEL CANCER, INFECCIONES VIRICAS Y ENFERMEDADES AUTOINMUNES.

Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido,

donde dicho anticuerpo no se une a dicho MHC clase I humano en ausencia de dicho antígeno HLA restringido, donde dicho anticuerpo no se une a dicho antígeno HLA restringido en ausencia de dicho MHC clase I humano y donde dicho anticuerpo se une a células infectadas por virus que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido, donde dicho antígeno HLA restringido es un antígeno viral que caracteriza al virus causante de la infección vírica o se une a células tumorales que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido, donde dicho antígeno HLA restringido es un antígeno tumoral que caracteriza al cáncer

Anticuerpo que tiene una especificidad tipo receptor de células T, con una afinidad aún mayor y el uso del mismo en la detección y tratamiento del cáncer, infecciones víricas y enfermedades autoinmunes.

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones.

Se demostró que la expresión de péptidos específicos en complejo con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I en células estaba asociada con cáncer y enfermedades autoinmunes (1-3) e infecciones víricas. En el cáncer, el descubrimiento de estos péptidos surgía de la observación ahora bien establecida de que las células tumorales humanas expresan con frecuencia antígenos que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos (CTL) obtenidos de pacientes (1-5).

Además, se ha demostrado que la respuesta inmune contra el tumor es insuficiente para causar la regresión tumoral y que las células tumorales pueden desarrollar mecanismos eficaces para escapar a dicho ataque inmune (6-9). Por lo tanto, se están desarrollando numerosas estrategias en el campo de la vacunación contra tumores en un intento por aumentar las respuestas inmunes antitumorales, incluyendo vacunas de péptidos contra el cáncer, vacunas autólogas contra el cáncer y la vacuna híbrida de células cancerosas-dendríticas (7, 10, 11).

Debido a que la especificidad de la respuesta inmune está regulada e impuesta por estos complejos de MHC clase I-péptido debería ser posible usar estos marcadores moleculares de superficie celular específicos y únicos como dianas para eliminar las células cancerosas, al tiempo que se evitan las células normales. Pueden emprenderse una estrategia similar para erradicar células infectadas por virus y células que presenten dianas para ataque autoinmune. Por lo tanto, sería muy deseable encontrar nuevas moléculas en una forma soluble que mimeticen la especificidad única refinada del receptor de antígeno de célula T (TCR) para los complejos de MHC-péptido asociados con cáncer/infecciones víricas/enfermedades autoinmunes.

Una estrategia prometedora es generar anticuerpos recombinantes que se unirán al complejo de MHC-péptido expresado en las superficies de células cancerosas con la misma especificidad que el TCR. Estos anticuerpos únicos pueden equiparse posteriormente con un resto citotóxico efector tal como un radioisótopo, un fármaco citotóxico o una toxina. Por ejemplo, se fusionaron genéticamente anticuerpos que se dirigen a células cancerosas con toxinas potentes obtenidas tanto de plantas como de bacterias, generando de este modo moléculas denominadas inmunotoxinas recombinantes (12).

Los anticuerpos con la especificidad de células T restringida por MHC son poco frecuentes y han sido difíciles de generar mediante técnicas de hibridoma convencionales debido a que las células B no aprenden a autorrestringirse por MHC (13-16). Las ventajas de la tecnología de anticuerpos presentados en fagos también hace posible seleccionar grandes repertorios de anticuerpos para anticuerpos únicos y poco frecuentes contra epítopos muy definidos. Esto se ha demostrado por la capacidad para aislar mediante presentación en fagos un anticuerpo restringido similar a TCR contra un H-2K^k de MHC clase I murino formando un complejo con un epítopo viral (17). Evidentemente, este anticuerpo, que está dirigido al MHC de ratón, es inútil en el tratamiento y diagnóstico de seres humanos. Hasta ahora, han fracasado los intentos realizados por el mismo grupo para desarrollar un anticuerpo restringido similar a TCR contra un MHC clase I humano. Más recientemente se aisló un anticuerpo reactivo con el antígeno de melanoma MAGE-A1 en un complejo con HLA-A1; sin embargo, este anticuerpo presentaba una baja afinidad y podía usarse para detectar los complejos específicos en la superficie de células presentadoras de antígeno sólo cuando se expresan de una forma multimérica en un fago y no como un anticuerpo soluble (18).

El documento WO-A-9702342 describe un método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconozca específicamente un complejo de péptido-MHC. También se refiere a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención que están conjugados con un agente farmacéutico o con un superantígeno. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención para la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas y autoinmunes y del cáncer, y a composiciones para el diagnóstico de dichas enfermedades.

El documento WO-A-91/12332 se refiere a anticuerpos monoclonales restringidos caracterizados por su capacidad para reconocer específicamente un complejo que consiste en un péptido, que es característico de un antígeno de agente patógeno o un trastorno celular, y una molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) que tiene la capacidad de reconocer y fijar este péptido, siendo dichos anticuerpos anticuerpos monoclonales restringidos en el sentido de que son incapaces de reconocer dicho péptido combinado con una molécula de MHC de haplotipo inespecífico de péptido. Estos anticuerpos pueden usarse para diagnosticar afecciones causadas por agentes infecciosos o trastornos celulares que se encontrarán, por ejemplo, en tumores o enfermedades autoinmunes.

Reither et al, Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, Abril 1997, páginas 4631-4636 se refiere a la destrucción específica de péptido de células presentadoras de antígeno mediante una proteína de fusión recombinante de anticuerpo-toxina dirigida contra complejos de complejo mayor de histocompatibilidad/péptido clase I con especificidad similar a receptor de célula T.

El documento WO-A-01/96401 describe un método para construir un anticuerpo scFv que tiene una proteína fluorescente fusionada con el mismo y que muestra una actividad de unión a un antígeno. Se prepara una biblioteca de anticuerpos scFv compuesta por clones de fagos con la expresión de anticuerpo scFv en la superficie. A partir de esta biblioteca, se selecciona un clon que exprese un anticuerpo que reconozca un antígeno específico. Después, se obtiene un gen de scFv a partir de este clon y se transfiere a un vector de expresión en el que se ha integrado previamente un gen que codifica una proteína fluorescente. Mediante la expresión del vector en un hospedador, puede producirse un anticuerpo scFv que tenga la proteína fluorescente fusionada con el mismo.

Chames et al describe la selección directa de un fragmento de anticuerpo humano dirigido contra el epítopo de célula T tumoral HLA-A1-MAGE-A1 a partir de una biblioteca no inmunizada de fagos-Fab, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA vol. 97, no. 14, 05 Julio 2000, páginas 7969-7974.

Cohen et al se refieren a la detección directa y a la cuantificación de un epítopo de célula T diferente obtenido de mucina asociada con células epiteliales específicas de tumor usando anticuerpos recombinantes humanos dotados con la especificidad restringida por complejo específico de antígeno de células T, Cancer Research vol. 62, 15 de Octubre de 2002, páginas 5835-5844.

Por lo tanto existe la necesidad ampliamente reconocida, y sería altamente ventajoso, tener un anticuerpo restringido similar a TCR contra un MHC clase I humano desprovisto de las limitaciones anteriores.

Sumario de la invención

En los últimos años, se han aislado muchos péptidos restringidos por MHC asociados con cáncer, asociados con infecciones víricas y enfermedades autoinmunes, y debido a su especificidad refinada altamente restringida, son dianas deseables para nuevas estrategias en inmunoterapia e inmunodiagnóstico. Los anticuerpos que son capaces de reconocer complejos de MHC-péptido asociados con cáncer, asociados con infecciones víricas y enfermedades autoinmunes, con la misma especificidad que el receptor de antígeno de célula T serían reactivos valiosos para estudiar la presentación de antígenos por células tumorales, células infectadas por virus y células relacionadas con enfermedades autoinmunes, para visualizar complejos de MHC-péptido en dichas células y, en última instancia, para desarrollar nuevos agentes de direccionamiento para inmunoterapia e inmunodiagnóstico del cáncer, infecciones víricas y enfermedades autoinmunes.

Cuando se reduce la presente invención a la práctica, y para generar moléculas ejemplares con una especificidad refinada única de este tipo, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 con un...

1. Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, donde dicho anticuerpo no se une a dicho MHC clase I humano en ausencia de dicho antígeno HLA restringido, donde dicho anticuerpo no se une a dicho antígeno HLA restringido en ausencia de dicho MHC clase I humano y donde dicho anticuerpo se une a células infectadas por virus que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido, donde dicho antígeno HLA restringido es un antígeno viral que caracteriza al virus causante de la infección vírica o se une a células tumorales que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido, donde dicho antígeno HLA restringido es un antígeno tumoral que caracteriza al cáncer.

2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y un resto terapéutico que se conjuga con dicho anticuerpo.

3. Una composición de diagnóstico que comprende una molécula que comprende al anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y un resto identificable que se conjuga con dicho anticuerpo.

4. Una molécula aislada que comprende un primer polinucleótido que codifica el anticuerpo aislado de la reivindicación 1.

5. Un método de producción de un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, comprendiendo el método:

inmunizar un mamífero no humano modificado genéticamente que tiene células que expresan dicho complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano con un complejo de MHC clase I de cadena sencilla y dicho antígeno HLA restringido, incluyendo dicho MHC clase I de cadena sencilla una secuencia de aminoácidos de ß-2 microglobulina humana funcional unida covalentemente directa o indirectamente a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MHC clase I humano funcional que se produce por bacterias en cuerpos de inclusión de E. coli;

aislar moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos de dicho mamífero no humano;

producir una biblioteca de fagos que presenten moléculas proteicas codificadas por dichas moléculas de ARNm; y

aislar al menos un fago de dicha biblioteca por selección contra dicho complejo de dicho MHC clase I de cadena sencilla y dicho antígeno HLA restringido, presentando al menos dicho fago dicho anticuerpo que puede unirse específicamente con dicha afinidad inferior a 20 nanomolar a dicho complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido.

6. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la reivindicación 1 conjugado con un resto terapéutico para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer.

7. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo aislado de la reivindicación 1 que conjugado con un resto terapéutico para la fabricación de un medicamento para tratar una infección vírica.

8. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende un fragmento de anticuerpo.

9. El anticuerpo aislado de la reivindicación 8, en el que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', Fv y Fv de cadena sencilla (scFv).

10. Un método de generación de una inmunotoxina, comprendiendo el método ligar el primer polinucleótido de la reivindicación 4 en fase de lectura con un segundo polinucleótido que codifica un resto de toxina, para obtener un polinucleótido ligado y expresar dicho polinucleótido ligado en un sistema de expresión para obtener dicha inmunotoxina.

11. Un método de generación de un inmunomarcador, comprendiendo el método ligar el primer polinucleótido de la reivindicación 4 en fase de lectura con un segundo polinucleótido que codifica un resto identificable, para obtener un polinucleótido ligado y expresar dicho polinucleótido ligado en un sistema de expresión para obtener dicho inmunomarcador.

12. Un método de detección de la presencia y/o el nivel de células presentadoras de antígeno que presentan un antígeno HLA restringido en una muestra de células, comprendiendo el método:

hacer interaccionar las células de dicha muestra con el anticuerpo aislado de la reivindicación 1; y

controlar dicha interacción, detectando de este modo la presencia y/o el nivel de dichas células presentadoras de antígeno que presentan dicho antígeno HLA restringido.

13. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7 o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A2.

14. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que comprende además un resto identificable que se conjuga con dicho anticuerpo.

15. La molécula aislada de la reivindicación 4, que comprende además un segundo polinucleótido que se une a dicho primer polinucleótido y que codifica un resto identificable.

16. El anticuerpo aislado de la reivindicación 14, la molécula aislada de la reivindicación 15 o la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, donde dicho resto identificable se selecciona del grupo que consiste en un miembro de un par de unión y un marcador.

17. El anticuerpo aislado, la molécula aislada o la composición de diagnóstico de la reivindicación 16, donde dicho miembro de dicho par de unión es un antígeno.

18. El anticuerpo aislado, la molécula aislada o la composición de diagnóstico de la reivindicación 16, donde dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en una proteína fluorescente y una enzima.

19. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que comprende además un resto terapéutico que se conjuga con dicho anticuerpo.

20. El anticuerpo aislado de la reivindicación 19, la composición farmacéutica de la reivindicación 2 o el uso de la reivindicación 6 ó 7, donde dicho resto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un resto citotóxico, un resto tóxico, un resto de citocina y un resto de anticuerpo biespecífico.

21. El método de la reivindicación 5, en el que dicho antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido tumoral.

22. El método de la reivindicación 5, en el que dicho antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido viral.

23. El método de la reivindicación 5, en el que dicho antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido autoinmune.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25. La molécula aislada de la reivindicación 4, que comprende además un segundo polinucleótido que se une a dicho primer polinucleótido y que codifica un resto citotóxico.

26. El método de la reivindicación 5, en el que dicho mamífero no humano está desprovisto de moléculas de MHC clase I propias.

27. Un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido como se expone en la SEC ID Nº: 8.

28. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº: 9.

29. Un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido como se expone en la SEC ID Nº: 9.

30. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A3.

31. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A24.

32. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A28.

33. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A31.

34. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A33.

35. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A34.

36. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-B7.

37. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-B45.

38. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-Cw8.