Proteínas de fusión, usos de las mismas y procesos para producir las mismas.

Una proteína de fusión que comprende aminoácidos consecutivos que,

comenzando en el extremo amino de la proteína, corresponden a aminoácidos consecutivos presentes en (i) un péptido restringido por CMH humano de citomegalovirus, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) una b-2 microglobulina humana, (iv) un segundo enlazador peptídico, (v) una cadena HLA-A2 de una molécula CMH de clase I humana, (vi) un tercer enlazador peptídico, (vii) una región variable de una cadena pesada de un fragmento scFv de un anticuerpo, y (viii) una región variable de una cadena ligera de tal fragmento scFv, en la que los aminoácidos consecutivos que corresponden a (vii) y (viii) se unen juntos directamente por un enlace peptídico o por aminoácidos consecutivos que corresponden a un cuarto enlazador peptídico, y el fragmento scFv se obtiene a partir de un anticuerpo que se une específicamente a mesotelina, en el que los aminoácidos consecutivos tienen la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO: 2.

Proteínas de fusión, usos de las mismas y procesos para producir las mismas.

5 La presente invención se refiere a una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 de la presente invención, una composición de acuerdo con la reivindicación 2 de la presente invención, una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 de la presente invención, un vector de acuerdo con la reivindicación 4 de la presente invención, una célula transformada de acuerdo con la reivindicación 5 de la presente invención, una preparación aislada de cuerpos de inclusión expresados por bacterias de acuerdo con la reivindicación 6 de la 10 presente invención, un proceso para producir una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7 de la presente invención.

De acuerdo con la teoría de vigilancia inmunológica actual, el sistema inmune continuamente localiza y destruye células transformadas. Sin embargo, algunas células escapan de una respuesta inmunológica aparentemente eficaz 15 y en consecuencia se convierten en tumores (1-4). La evasión tumoral de la respuesta inmunológica es un fenómeno bien establecido demostrado en numerosos estudios y está causado por una amplia variedad de mecanismos sugeridos (1-4). Entre estos mecanismos se encuentran: la producción de citocinas supresoras, la pérdida de péptidos inmunodominantes, la resistencia a mecanismos de eliminación (apoptosis) y la pérdida de CMH de clase I (1-4). Uno de los mecanismos de evasión que muestra estar fuertemente correlacionado con la progresión tumoral 20 es la pérdida o regulación descendente de moléculas CMH de clase I. Este mecanismo de invasión es abundante en muchos tumores y puede resultar de varias mutaciones diferentes. Varios estudios revelaron puntos débiles en la ruta de carga y presentación de CMH de clase I, incluyendo pérdida de beta-2-microglobulina, mutaciones TAP1/TAP2, mutaciones LMP, pérdida de heterocigosidad en los genes CMH, y regulación descendente de alelos CMH específicos.

Las estrategias de inmunoterapia contra el cáncer actuales emplean típicamente las dos ramas del sistema inmune: los sistemas humoral y celular. En el primero, la inyección sistémica de anticuerpos monoclonales de alta afinidad (mAbs) dirigidos contra antígenos asociados con el tumor de superficie celular ha demostrado actividad anti-tumoral estadísticamente significativa en ensayos clínicos (5, 6). Además, los mAbs anti-tumorales que llevan efectores, 30 tales como citocinas o toxinas, están siendo evaluados actualmente en ensayos clínicos (7). El segundo enfoque principal para la inmunoterapia contra el cáncer específico emplea el brazo celular del sistema inmune, principalmente los linfocitos T citotóxicos CD8+. Se están usando actualmente dos estrategias principales para aumentar la eficacia anti-tumoral del brazo celular del sistema inmune: (1) inmunización activa de pacientes con péptidos conocidos por ser reconocidos por los linfocitos T, y (ii) terapias de transferencia adoptiva que permiten la 35 selección, activación y expansión de sub-poblaciones de linfocitos T altamente reactivos con una mejor potencia anti-tumoral. En el primer enfoque, los péptidos restringidos por CMH obtenidos a partir de antígenos asociados con tumor identificados recientemente (tales como gp100, el grupo MAGE, NY-ESO-1) se usan para vacunar pacientes. Estos péptidos derivados de antígeno específico de tumor son altamente específicos debido a su expresión exclusiva en tejidos específicos (8-11). La segunda estrategia, transferencia de células adoptiva, recientemente ha 40 mostrado resultados impresionantes en pacientes con melanoma metastásico en los que los linfocitos T reactivos a tumor altamente seleccionados contra diferentes antígenos de diferenciación auto-derivados sobre-expresados se aislaron, se consumieron ex vivo y se introdujeron de nuevo en los pacientes. En este enfoque se demostraron una repoblación clonal persistente de linfocitos T, proliferación in vivo, actividad funcional, y tráfico a sitios de tumor (12- 14).

Un nuevo enfoque inmunoterapéutico presentado recientemente aprovecha dos áreas bien establecidas: (i) la eficacia conocida de los linfocitos T citotóxicos CD8+ en la eliminación de células que presentan complejos CMH/péptidos altamente inmunogénicos, y (ii) los antígenos de superficie celular específicos de tumor dirigidos a través de fragmentos recombinantes de anticuerpos, principalmente fragmentos Fv de cadena sencilla (scFvs). Este 50 enfoque utiliza una proteína de fusión recombinante compuesta de dos entidades funcionalmente distintas: (i) una molécula CMH de clase I de cadena sencilla que lleva un tumor altamente inmunogénico o péptido derivado de un virus, y (ii) un fragmento scFv de alta afinidad, específico de tumor (15). Varios grupos han mostrado previamente que un péptido CMH biotinilado multimerizado en estreptavidina o complejos de péptido de matriz de influenza (Flu)/HLA-A2 monomérico acoplados a través de conjugación química a anticuerpos específicos de tumor podrá 55 inducir la lisis mediada por linfocitos T in vitro de células tumorales revestidas (16-20). Sin embargo, estos enfoques utilizan conjugación química y usan anticuerpos completos o fragmentos más grandes, por ejemplo fragmentos Fab. Sin embargo, la producción y homogeneidad a causa de la estrategia de acoplamiento, así como la capacidad de penetración tumoral son limitadas debido al gran tamaño de dichas moléculas. Lev y col. describen una fusión genética creada entre HLA-A2 recombinante de cadena sencilla y scFv específicos de tumor. Se mostró que estas

fusiones son funcionales in vitro e in vivo, siendo capaces de inducir específicamente el linfocito T mediado en lisis in vitro e in vivo de células tumorales revestidas por diana (15). La estabilidad de la nueva molécula quimérica es altamente dependiente de la presencia del péptido en el surco de CMH. Por lo tanto, la disociación del péptido del dominio scHLA-A2 de la molécula quimérica puede deteriorar su estabilidad. Oved y col. abordan este problema 5 construyendo nuevas moléculas quiméricas en las que el péptido se conecta a la construcción scHLA-A2/scFv a través de un enlazador corto. Esta nueva proteína de fusión se ensayó para evaluar su actividad bioquímica y biológica in vitro (21).

Existe una necesidad ampliamente reconocida de una nueva proteína de fusión que pueda mantener su actividad 10 dual: unir células diana de tumor a través del resto scFv, así como mediar una citotoxlcldad potente, eficaz y específica a través del reclutamiento de linfocitos T CD8+ cuya especificidad se gobierna por el péptido restringido por FILA-A2 unido covalentemente.

El brazo efector de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ restringido por CMH de clase I de la respuesta inmune 15 adaptativa está mejor equipado para reconocer las células tumorales como extrañas e iniciar la cascada de eventos que dan como resultado la destrucción tumoral. Sin embargo, los tumores han desarrollado estrategias sofisticadas para escapar de mecanismos efectores inmunes, de los cuales el mejor estudiado es la regulación descendente de moléculas CMH de clase I que presentan los antígenos reconocidos por los CTL.

20 Para superar la limitación de los enfoques previos y desarrollar nuevos enfoques para ¡nmunoterapia, se construyó una molécula recombinante en la que una CMH de cadena sencilla se dirige específicamente a las células tumorales a través de su fusión a fragmentos de anticuerpos recombinantes específicos de cáncer o un ligando que se une a receptores expresados por células tumorales.

25 KFIR OVED y col. se refieren a «antlbody-medlated targeting of human single-chain class I MHC with covalently linked peptldes ¡nducing efflclent kllllng of tumor cells by tumor or vlral-specific cytotoxic T lymphocytes», cáncer immunology, ¡mmunotherapy, Springer, Berlín, Al., vol. 54, N° 9, 1 de septiembre de 2005, páginas 867-879.

Hassan R y col. se refieren a "Mesothelin: a newtarget for ¡mmunotherapy", clinical cáncer research, the American 30 association for cáncer research, Estados Unidos, vol. 10, N° 12, parte 01, 15 de junio de 2004, páginas 3937-3942.

La proteína de fusión de la presente invención se define en la reivindicación 1, la composición de la presente invención se define en la reivindicación 2, la construcción de ácido nucleico de la presente invención se define en la reivindicación 3, el vector de la presente invención se define en la reivindicación 4, la célula transformada de la 35 presente invención se define en la reivindicación 5, la preparación aislada de cuerpos de inclusión expresados por bacterias de la presente invención se define en la reivindicación... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión que comprende aminoácidos consecutivos que, comenzando en el extremo amino de la proteína, corresponden a aminoácidos consecutivos presentes en (i) un péptido restringido por CMH

5 humano de citomegalovirus, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) una |3-2 microglobulina humana, (iv) un segundo enlazador peptídico, (v) una cadena HLA-A2 de una molécula CMH de clase I humana, (vi) un tercer enlazador peptídico, (vii) una región variable de una cadena pesada de un fragmento scFv de un anticuerpo, y (viii) una región variable de una cadena ligera de tal fragmento scFv, en la que los aminoácidos consecutivos que corresponden a (vii) y (viii) se unen juntos directamente por un enlace peptídico o por aminoácidos consecutivos que corresponden a 10 un cuarto enlazador peptídico, y el fragmento scFv se obtiene a partir de un anticuerpo que se une específicamente a mesotelina, en el que los aminoácidos consecutivos tienen la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:

2.

2. Una composición que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de 15 fusión está presente en la composición en una cantidad terapéuticamente eficaz y un vehículo farmacéuticamente

aceptable.

3. Una construcción de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.

20 4. Un vector que comprende la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 3.

5. Una célula transformada que comprende el vector de la reivindicación 4.

6. Una preparación aislada de cuerpos de inclusión expresados por bacterias que comprende más del

25 30 por ciento en peso de la proteína de fusión de la reivindicación 1.

7. Un proceso para producir la proteína de fusión de la reivindicación 1 que comprende cultivar la célula transformada de la reivindicación 5, de manera que la proteína de fusión se exprese, y recuperar la proteína de

fusión.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 1, para su uso en inmunoterapia oncológica eliminando selectivamente una célula tumoral iniciando una respuesta inmune mediada por CTL contra la célula tumoral.

9. La proteína de fusión de la reivindicación 1, para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que 35 dicha célula tumoral expresa mesotelina sobre su superficie.