Método de cribaje para la identificación de un candidato a fármaco que es un inhibidor de aminoacil-tRNA sintetasa patógena en el que dicho método comprende las siguientes etapas:

a) obtener un vector d expresión que comprende una secuencia de un gen que codifica una tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza;

b) transformar células aisladas de un mamífero con el vector de expresión;

c) crecimiento de las células recombinantes resultantes de (b) en un medio con nutrientes en condiciones que permiten la expresión de la tRNA sintetasa patógena, lo que resulta en muerte celular;

d) proporcionar una sustancia a ensayar; y

e) analizar el crecimiento celular resultante, en donde si hay un aumento de crecimiento celular con respecto al crecimiento celular del mismo cultivo en ausencia de las sustancia a ensayar, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de la tRNA sintetasa patógena y no afecta a su ortólogo celular, lo que indica que dicha sustancia es un candidato a fármaco

Procedimiento de cribado para la identificación de nuevos fármacos.

La presente invención está relacionada con un nuevo método de exploración que permite la identificación de nuevos fármacos. Particularmente, la presente invención se refiere a un método de exploración para la selección de compuestos inhibidores de aminoacil-tRNA sintetasa (ARS) que pueden ser útiles como agentes antibacterianos y antifúngicos, entre otros.

Antecedentes de la técnica

En programas modernos de descubrimiento de fármacos las bibliotecas químicas se usan en combinación con sistemas robóticos para evaluar rápidamente el efecto de grandes cantidades de compuestos en una reacción dada. Este enfoque tiene dos principales inconvenientes. Primero, con frecuencia es necesario desarrollar un ensayo bioquímico que pueda controlarse fácilmente con el fin de identificar nuevos compuestos candidatos. Este procedimiento es costoso e insensible debido a potenciales efectos negativos de los fármacos seleccionados. Segundo, este enfoque ignora los parámetros de biodisponibilidad y toxicidad. La mayoría de los compuestos inicialmente seleccionados se descartan posteriormente debido a problemas de solubilidad, biodisponibilidad o toxicidad.

Las aminoacil-tRNA sintetasas (en lo sucesivo en la presente memoria llamadas "ARS") representan dianas ideales para el desarrollo de fármacos debido a que son enzimas esenciales de distribución universal, cuya naturaleza ancestral permite la selección de inhibidores específicos. Además, son solubles, estables, fáciles de expresar y purificar en grandes cantidades y sencillas de ensayar mediante uno o más métodos. Las estructuras de rayos X están disponibles para ejemplos de todas las sintetasas y se sabe mucho acerca del mecanismo de la reacción de aminoacilación (consúltese, Weygand-Durasevic I. et al., "Yeast seryl-tRNA synthetase expressed in Escherichia coli recognizes bacterial serine-specific tRNAs in vivo", Eur. J. Biochem., 1993, vol. 214, pp. 869-877).

Las ARS catalizan la ligación de aminoácidos específicos a ARNt afines. Esta reacción tienen lugar dentro de un dominio de sitio activo único y transcurre típicamente en dos etapas. Primero, el aminoácido se activa con ATP para formar aminoaciladenilato con liberación de pirofosfato. A continuación, el aminoácido se transfiere al extremo 3' del ARNt para generar aminoacil ARNt y AMP. Esta reacción en dos etapas establece el código genético mediante la unión de tripletes de tripletes nucleotídicos específicos (anticodones de ARNt) con aminoácidos específicos. Cada aminoácido se reconoce por su propia ARS específica, que está universalmente distribuida. Las aminoacil tRNA sintetasas se dividen uniformemente en dos clases de aproximadamente 10 enzimas cada una. Todas las enzimas dentro de una clase parecen haber evolucionado a partir de una proteína de unión a ATP de dominio único. Las inserciones en y las variaciones de este dominio establecieron un armazón para la unión al brazo aceptor de ARNt. A lo largo de la evolución se añadieron dominios adicionales a esta estructura central.

El reconocimiento de ARNt por aminoacil tRNA sintetasas depende principalmente de la interacciones moleculares con el sistema aceptor y el bucle del anticodón del ARNt (consúltese Rich, A. "RNA structure and the roots of protein synthesis", Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 2001, vol. 66, pp. 1-16). Los dominios de sitio activo de las enzimas se unen al brazo aceptor de la molécula de ARNt, donde se une el aminoácido. La base "discriminadora" (la base no emparejada que precede a la secuencia universal CCA) y los primeros tres pares de bases del brazo aceptor albergan la mayoría de los elementos de identidad reconocidos por los sitios activos de ARS.

El documento US 6 475 726 describe un método para la identificación de uno o más compuestos que son candidatos para la unión a un componente celular diana en un patógeno e inhibir la infección de un mamífero mediante patógeno que comprende: a) la construcción de un patógeno que comprende un gen regulable que codifica una biomolécula que se une al componente celular diana; b) la infección de uno o más animales de ensayo con el patógeno construido y uno o más animales control con el patógeno construido o con un patógeno de control; c) la regulación de la expresión del gen regulable para producir la biomolécula en animales de ensayo; d) el control de los animales de ensayo y los animales de control con respecto a señales de infección, en el que la observación de señales de infección más escasas o menos graves en los animales de ensayo que en los animales control indica que la biomolécula es un inhibidor biomolecular de la infección por el patógeno; y e) la identificación de uno o más compuestos que compiten con el inhibidor biomolecular de la infección por la unión al componente celular diana en un ensayo de unión competitiva; mediante el cual, si un compuesto compite con el inhibidor biomolecular de infección por la unión al componente celular diana, entonces el compuesto es un candidato para la unión al componente celular diana en el patógeno y la inhibición de la infección de un mamífero por el patógeno.

El documento WO 02/04611 describe aminoacil tRNA sintetasas humanas (ATRS) y polinucleótidos que identifican y codifican dichas sintetasas.

Los documentos EP 785 258 y EP 1 300 468 describen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican tRNA sintetasa, particularmente de tRNA sintetasa de Staphylococcus aureus incluyendo ARNm, ADNc, ADN genómicos.

Entre los antibióticos comerciales dirigidos a la traducción uno se dirige a tRNA sintetasa. El ácido seudomónico (mupirocina) es un inhibidor de isoleucil-tRNA sintetasa (IleRS) de patógenos infecciosos Gram positivos. El ácido seudomónico tiene una selectividad aproximadamente 8000 veces para IleRS de patógeno frente a de mamífero, pero la falta de biodisponiblidad sistémica del fármaco limita su uso a aplicaciones tópicas.

Aunque existen otros inhibidores de producto natural dirigidos contra sintetasas (por ejemplo, borrelidina, furanomicina, granaticina, etc.), ninguno de estos se ha desarrollado para antibióticos comerciales debido a la falta de actividad inhibidora, baja especificidad o baja biodisponibilidad. Así pues, se requiere un método más eficiente para la selección de inhibidores de ARS para explorar grandes bibliotecas químicas e identificar candidatos a fármaco prometedores.

Descripción resumida de la invención

El objetivo de la presente solicitud es proporcionar un método de exploración para la selección de inhibidores de ARS.

Se proporciona un método de exploración positivo que implica que el efecto deseado de un compuesto candidato potencial es el rescate y/o estimulación del crecimiento de células de mamífero y no la inhibición de cualquier reacción dada o la detención del crecimiento de un cultivo celular. Así pues, en la selección positiva que se propone aquí, el crecimiento de células de mamífero (y en particular de células humanas) se rescataría mediante las moléculas capaces de inhibir la acción tóxica de una ARS diana. Este efecto podría controlarse simplemente mediante la medición de la densidad de cultivo, un procedimiento rápido y barato.

Así pues, un aspecto de la presente invención es la provisión de un método de exploración para identificar un candidato a fármaco, comprendiendo dicho método las etapas de: a) la obtención de un vector de expresión que comprende una secuencia génica que codifica una tRNA sintetasa patógena de origen natural no discriminante; b) la transformación de células mamíferas aisladas con el vector de expresión; c) el crecimiento de las células recombinantes que resultan de (b) en un medio nutritivo en condiciones que permitan la expresión de la tRNA sintetasa patógena, resultando la expresión de la tRNA sintetasa patógena en muerte celular o disminución de la tasa de división celular; d) proporcionar una sustancia a ensayar; y e) el análisis del crecimiento celular resultante, en el que si hay un aumento de crecimiento celular, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de la tRNA sintetasa patógena y no afecta a su ortólogo celular, resultando que dicha sustancia es un candidato a fármaco.

Preferiblemente, las células mamíferas aisladas son células humanas aisladas.

El método de exploración de la presente invención se basa en la estrategia de si una ARS no específica es tóxica para las células y esa toxicidad puede conseguirse sin...

1. Método de cribaje para la identificación de un candidato a fármaco que es un inhibidor de aminoacil-tRNA sintetasa patógena en el que dicho método comprende las siguientes etapas:

a) obtener un vector d expresión que comprende una secuencia de un gen que codifica una tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza;

b) transformar células aisladas de un mamífero con el vector de expresión;

c) crecimiento de las células recombinantes resultantes de (b) en un medio con nutrientes en condiciones que permiten la expresión de la tRNA sintetasa patógena, lo que resulta en muerte celular;

d) proporcionar una sustancia a ensayar; y

e) analizar el crecimiento celular resultante, en donde si hay un aumento de crecimiento celular con respecto al crecimiento celular del mismo cultivo en ausencia de las sustancia a ensayar, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de la tRNA sintetasa patógena y no afecta a su ortólogo celular, lo que indica que dicha sustancia es un candidato a fármaco.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector de expresión obtenido en la etapa (a) también comprende una secuencia de un gen que codifica un sustrato de tRNA de la tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células de mamífero se transforman en la etapa (b) usando un segundo vector de expresión que comprende una secuencia de un gen que codifica un sustrato de tRNA de la tRNA sintetasa no discriminante patógena de que se encuentra en la naturaleza.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la t-RNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza se selecciona del grupo consistente en Glu-tRNA sintetasa y Asp-tRNA sintetasa.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el vector de expresión se selecciona del grupo consistente en un plásmido viral o no viral, cósmido, fagémido, vector lanzadera y yac.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5 en donde el vector de expresión es un vector de adenovirus.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde el vector comprende un sistema de regulación dependiente de tetraciclina para la expresión del gen.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde el vector comprende un marcador de selección.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el marcador de selección es higromicina.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza procede de una bacteria y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente antibacteriano que actúa inhibiendo selectivamente la función de la tRNA sintetasa no discriminante de origen bacteriano expresada en la célula de mamífero recombinante.

11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza procede de un hongo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente antifúngico que actúa inhibiendo selectivamente la función de la tRNA sintetasa no discriminante de origen fúngico expresada en la célula de mamífero recombinante.

12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza procede de un protozoo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente antiparasitario que actúa inhibiendo selectivamente la función de la tRNA sintetasa no discriminante de origen protozoario expresada en la célula de mamífero recombinante.

13. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza procede de un metazoo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente inhibidor que actúa inhibiendo selectivamente la función de la tRNA sintetasa no discriminante de origen metazoario expresada en la célula de mamífero recombinante.

14. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la célula de mamífero recombinante es una célula humana recombinante.