Uso de catecolamina para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos.

La presente invención se refiere al uso de catecolamina para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos y su maduración así como un método para la obtención y maduración de estas células cardíacas. Además, la catecolamina puede usarse para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un daño cardíaco

Uso de catecolamina para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos.

La presente invención se refiere al uso de catecolamina para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos así como un método para la obtención de estas células cardíacas. Además, la catecolamina puede usarse para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un daño cardíaco.

Estado de la técnica anterior

Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de mortalidad en los países desarrollados, con 32% de las causas de muerte en España (Instituto Nacional de Estadística) y 2 millones anuales en la Unión Europea (Estadísticas de enfermedad cardiovascular 2008). Por otro lado, el 1% de los niños nacidos en nuestro país presenta alguna enfermedad congénita cardíaca. La alteración de un único gen tiene graves implicaciones en el desarrollo del corazón, así mutaciones en GATA4, son la causa de defectos en la septación de aurícula y ventrículo (Garg et al. 2003. Nature, 424: 443-447), mutaciones en NKX2.5 además de los defectos citados en el caso de GATA4 también tiene defectos en la conducción eléctrica (Schott et al., (1998). Science, 281: 108-111). Mutaciones en TBX5 son las causantes del Síndrome de Holt-Oram, el cual tiene unos defectos similares a las mutaciones en NKX2.5 (Srivastava, 2006. Cell 126: 1037-1048).

La potencialidad de las células madre embrionarias en medicina regenerativa para la reparación y regeneración de tejidos y órganos vitales se ha puesto de manifiesto a lo largo de la última década (Narayan et al., 2006. Blood, 107: 2180-2183; Klug et al., 1996. J Clin Invest. 98: 216-224; Laflame et al., 2005. Nat Biotechnol. 23: 845-856; Ben-Hur y cols., 2004. Stem Cells 22: 1246-1255; Keirstad y cols., 2005. J Neurosci. 25, 4694-4705; Jiang et al., 2007. Cell Res. 17: 333-344). El atractivo de estas células radica en la capacidad de diferenciarse a cualquier tipo celular. Sin embargo, la implantación de las mismas en condiciones indiferenciadas en corazones infartados (Laflamme y Murry, 2005. Nat Biotechnol. 23: 845-856) han reportado resultados inesperados como la aparición de teratomas. Se ha propuesto que un paso de diferenciación in Vitro entre células pluripotentes y cardiomiocitos diferenciados, evitaría estos efectos adversos (Laflamme et al., 2007. Am J Pathol, 167: 663-671; Caspi et al. 2007. J Am Coll Cardiol, 50: 1884-1893).

Desde la primera vez que se aislaron las células madre de embriones preimplantados de ratón (Evans y Kaufman, 1981. Nature. 292: 154-156), se han establecido diversas líneas de células madre aunque no con todas se ha conseguido diferenciación a cardiomiocitos. El protocolo de diferenciación de las células madre embrionarias hacia un linaje cardíaco (Boeler et al., 2002. Circ Res. 91: 189-201), pasa por la formación de estructuras tridimensionales, denominadas cuerpos embrionarios (EB), en los cuales se encuentran representadas los tres linajes embrionarios: ectodermo, endodermo y mesodermo. Las células cardiacas, de origen mesodérmico, se sitúan en el EB entre una capa superficial epitelial y una capa basal de células mesenquimales (Hescheler et al., 1997. Cardiovasc Res. 36: 149-162). Dentro del EB, coexisten diferentes grados de diferenciación de cardiomiocitos. De esta forma, los cardiomiocitos menos diferenciados tendrían una forma redondeada, con miofibrillas desorganizadas y sus características serían similares a las células que constituyen el marcapasos del corazón. Los más diferenciados, tienen características similares a cardiomiocitos auriculares y ventriculares, y poseen miofibrillas altamente organizadas, observándose de forma definida las bandas Z, A e I que caracterizan a las sarcómeras de los miocardiocitos maduros (Hescheler et al., 1997. Cardiovasc Res, 36: 149-162).

Uno de los problemas que surge en la diferenciación de células madre es el reducido número de cardiomiocitos obtenidos, siendo del 1-3% en el caso de células madre embrionarias de ratón, e inferiores al 1% en el caso de las humanas (Murry y Keller, 2008. Cell, 132: 661-680). Ésto supone un inconveniente a la hora de utilizar dichas células para tratamiento clínico de enfermedades cardíacas, si tenemos en cuenta que un infarto de miocardio puede llegar a matar hasta tres mil millones de las aproximadamente ocho mil quinientos millones de células que componen un corazón adulto (Sánchez y García-Sancho, 2007. Cell Death Differ. 14:1258-1261). Por tanto, la mejora en la eficiencia de diferenciación cardiaca supondría un gran avance en el éxito de la terapia regenerativa para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Además de las células madre embrionarias se ha propuesto que el propio corazón adulto puede ser una fuente de precursores cardiacos con capacidad de diferenciación, y por tanto con potencial uso en medicina regenerativa.

A lo largo de la historia se ha pensado que las células del corazón adulto, al igual que las del cerebro no tenían capacidad de renovación. Sin embargo, mediante ensayos de proliferación y muerte celular se ha visto que en corazón de ratón el porcentaje diario de las células que se mueren es el mismo al de las células que proliferan (Sánchez y García-Sancho, 2007. Cell Death Differ, 14: 1258-1261). Esto supondría que las células del corazón adulto de ratón se renuevan por completo cada año, (Sánchez y García-Sancho, 2005. Stem Cell Therapy and Tissue Engineering for Cardiovascular Repair. Springer: New York, pp 121-134) y las del corazón adulto humano cada 5 años (Anversa et al., 2006. Circulation. 113: 1451-1463). Diferentes poblaciones de progenitores cardíacos se han descrito. Así Urbanek et al., 2006 describieron poblaciones de células con capacidad proliferativa ubicadas en nichos en el corazón, que se concentraban en la región auricular. Beltrami et al., 2003, aislaron una población de progenitores cardíacos de rata adulta que expresan c-kit. Tras expandir esta población In Vitro y posterior inyección en corazón con isquemia aguda consiguieron diferenciación a células de músculo liso, endotelio vascular y cardiomiocitos. También se han descrito otras poblaciones de progenitores cardíacos que expresan genes como Sca-1, (Oh et al., 2007. PNAS, 100: 12313-12318), o islet-1, (Cai et al., 2003. Dev Cell. 5: 877-889). Estas últimas crecen en condiciones indiferenciadas in Vitro, pero se diferencian a cardiomiocitos cuando son cultivadas en presencia de los cardiomiocitos diferenciados (Laugwitz et al., 2005. Nature. 433: 647-653).

A pesar de que estos progenitores presentes en corazones adultos proliferan y se diferencian en condiciones fisiológicas y cuando son cultivados in Vitro, no tienen capacidad de regeneración autónoma del parénquima cardíaco después de un daño cardiaco (Sánchez y García-Sancho, 2007. Cell Death Differ. 14: 1258-1261). Por tanto, tratamientos que estimulen las propiedades de proliferación y diferenciación de éstos precursores podrían estimular el potencial regenerativo del tejido cardiaco.

En este sentido, en la presente invención se presenta una solución al problema de la diferenciación de células madre a cardiomiocitos.

Explicación de la invención

En la presente invención se demuestra cómo las catecolaminas son capaces de inducir la diferenciación de varias líneas de células madre embrionarias de ratón a cardiomiocitos. Además, se han realizado estudios de la expresión de la enzima tirosina hidroxilasa (TH), primera enzima y paso limitante en la ruta de síntesis de las catecolaminas, detectándose ésta desde estadios previos al establecimiento de conexiones nerviosas en el embrión de pollo. Por tanto, la detección de la expresión de la TH en una región conocida como Hfr (del inglés Heart forming region, que corresponde a las células que van a formar el tubo cardiaco) en el embrión de pollo en gastrulación indica que el producto de esta reacción mediada por la TH, es decir, las catecolaminas, están implicadas en el desarrollo cardíaco mediante la diferenciación de células madre o progenitores cardiacos a cardiomiocitos.

En esta invención se demuestra que la L-DOPA y la dopamina inducen la expresión de proteínas contráctiles cardíacas como AMHC (miosina... [Seguir leyendo]

1. Uso de catecolamina para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos.

2. Uso según la reivindicación 1 donde la catecolamina se selecciona del grupo que consiste en: L-DOPA, dopamina, cualquiera de sus sales, análogos o cualquier combinación de las anteriores.

3. Uso de catecolamina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde las células madre son células madre embrionarias no humanas.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde las células madre embrionarias pertenecen a ratón.

5. Uso según la reivindicación 3 donde las células madre embrionarias pertenecen a la línea celular E14 de ratón.

6. Uso según la reivindicación 3 donde las células madre embrionarias pertenecen a la línea celular HM1 de ratón.

7. Uso de catecolamina para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un daño cardíaco mediante la diferenciación de células : madre a cardiomiocitos.

8. Método para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos que comprende:

a. cultivar una línea de células madre en un medio de cultivo de diferenciación,

b. adicionar catecolamina al medio de diferenciación en el que se encuentran las células cultivadas según (a),

c. renovar periódicamente el medio de cultivo de diferenciación con catecolamina del paso (b),

d. recolectar los cardiomiocitos generados en (c).

9. Método según la reivindicación 8 donde las células madre son células madre embrionarias no humanas y comprende:

a. cultivar una línea celular en un medio de cultivo de diferenciación para obtener cuerpos embrionarios,

b. recolectar los cuerpos embrionarios obtenidos en (a),

c. adicionar catecolamina al medio de diferenciación donde se encuentran los cuerpos embrionarios obtenidos en (b),

d. renovar periódicamente el medio de cultivo de diferenciación con catecolamina del paso (c),

e. recolectar los cardiomiocitos generados en (d).

10. Método según la reivindicación 9 donde las células madre embrionarias pertenecen a la línea celular E14 de ratón.

11. Método según la reivindicación 9 donde las células madre embrionarias pertenecen a la línea celular HM1 de ratón.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 donde la catecolamina se selecciona del grupo que consiste en: L-DOPA, dopamina, cualquiera de sus sales, análogos o cualquier combinación de las anteriores.

13. Método según la reivindicación 12 donde la concentración de L-DOPA y/o dopamina es de entre 1 y 50 μM.