PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR O MONITORIZAR LA SEPTICEMIA ANALIZANDO NIVELES DE EXPRESIÓN DE ARNm DE CITOCINAS.
Procedimiento para predecir una respuesta en pacientes humanos a una infección,
comprendiendo el procedimiento determinar un valor de ARNm de IL-23 en una muestra del paciente, y correlacionar el valor con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección, en el que un valor de ARNm de IL-23 bajo se correlaciona con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección, y un valor de ARNm de IL-23 alto se correlaciona con una probabilidad de que el paciente no desarrolle septicemia en respuesta a la infección
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IE2006/000133.
Solicitante: THE PROVOST, FELLOWS AND SCHOLARS OF THE COLLEGE OF THE HOLY AND UNDIVIDED TRINITY OF QUEEN ELIZABETH NEAR DUBLIN.
Nacionalidad solicitante: Irlanda.
Dirección: COLLEGE GREEN DUBLIN 2 IRLANDA.
Inventor/es: KELLEHER,DERMOT, STORDEUR,PATRICK, MCMANUS,OWEN,ROSS, O'DWYER,MICHAEL, RYAN,THOMAS.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 27 de Noviembre de 2006.
Fecha Concesión Europea: 30 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68M6
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para detectar o monitorizar la septicemia analizando niveles de expresión de ARNm de citocinas.
Introducción
La infección masiva con insuficiencia multiorgánica resultante, que se ha denominado "síndrome septicémico" [1], es una enfermedad devastadora, y es un diagnóstico de admisión común en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI), con una incidencia de 3 por 1000 en la población al año [2]. El síndrome septicémico se ha caracterizado como una desregulación de la inflamación en respuesta a la infección, con insuficiencia orgánica potencialmente mortal que puede atribuirse a una combinación de excesiva inflamación mediada por citocinas, coagulopatía diseminada y alteración de la integridad del endotelio microvascular [3].
De particular importancia para la respuesta del huésped a un patógeno invasor es la inducción de diferentes elementos de la población de células T cooperadoras CD4+. La respuesta de citocinas distales a la infección se regula principalmente mediante la población de células T CD4+ inducidas, que a su vez se determina mediante la interacción antagonista de las citocinas interleucina 12 (IL-12) e interleucina 4 (IL-4). Estas citocinas inducen que las células T CD4+ vírgenes se diferencien fenotípicamente en células T cooperadoras 1 (Th1) o Th2 respectivamente [4, 5]. La interleucina-6 (IL-6) también desempeña un papel en la diferenciación de Th1/Th2 promoviendo la diferenciación de Th2 principalmente induciendo la producción de IL-4, mientras que inhibe la diferenciación de Th1 mediante un mecanismo independiente de IL-4 [6].
La respuesta celular Th1 generalmente se induce mediante, y particularmente es eficaz frente a, patógenos intracelulares y aquellos que activan macrófagos y células citolíticas naturales (NK). Una respuesta Th1 está asociada con inmunidad mediada por células potenciada y es por tanto la respuesta apropiada esperada frente a los ataques septicémicos más comunes. Los linfocitos que demuestran un patrón de respuesta Th1 producen de manera característica interferón-gamma (IFNγ), una citocina pleiotrópica que funciona principalmente en la optimización de la actividad bactericida de los fagocitos.
Por el contrario, las respuestas sesgadas hacia Th2 son responsables clásicamente de la defensa frente a infecciones helmínticas y por artrópodos y son un componente esencial de las reacciones de tipo alérgico. Las células Th2 maduras secretan preferentemente varias citocinas, incluyendo interleucina 10 (IL-10). Sin embargo, los anticuerpos estimulados mediante esta respuesta no promueven la fagocitosis ni activan el complemento de manera eficaz.
El documento WO 2004/108957 da a conocer un procedimiento para el diagnóstico y/o pronóstico de un síndrome septicémico en un paciente humano determinando los niveles de ARNm respectivos para una pluralidad de marcadores biológicos de citocinas, entre ellos TGF-alfa, IL-10, TGF-beta, IL-1beta, en una muestra de sangre periférica de un paciente humano.
Existe una necesidad de determinar más claramente la respuesta celular a una infección y los factores que afectan a la respuesta.
Exposición de la invención
Según la invención, se proporciona un procedimiento para predecir una respuesta en pacientes humanos a una infección, comprendiendo el procedimiento determinar un valor de ARNm de IL-23 en una muestra del paciente, y correlacionar el valor con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección, en el que un valor de ARNm de IL-23 bajo se correlaciona con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección, y un valor de ARNm de IL-23 alto se correlaciona con una probabilidad de que el paciente no desarrolle septicemia en respuesta a la infección.
De manera adecuada, la muestra son células mononucleares de sangre periférica, en la que un valor de ARNm de IL-23 bajo se correlaciona con menos de 1824 copias de ARNm de IL-23 por 10 millones de copias de β-actina, y un valor de ARNm de IL-23 alto se correlaciona con 1824 o más copias de IL-23 por 10 millones de copias de beta-actina.
En un aspecto, la invención incluye una etapa de predecir además el desenlace de la septicemia en un paciente, comprendiendo el procedimiento las etapas de determinar una razón de los valores de ARNm de IL-27:IL-23 en una muestra del paciente, en el que una razón mayor de 1,45 se correlaciona con muerte y una razón menor de 1,45 se correlaciona con supervivencia.
Normalmente, la etapa de predecir el desenlace incluye además determinar una razón de los valores de ARNm de IL-10:IFN-γ en una muestra del paciente, en la que una razón mayor de 2,85 se correlaciona con muerte y una razón menor de 2,85 se correlaciona con supervivencia.
De manera adecuada, el procedimiento de predecir el desenlace comprende un sistema de puntuación en el que se asigna a un paciente una puntuación de 1 ó 0 dependiendo de si la razón de los valores de ARNm de IL-27:IL-23 está por encima o por debajo de 1,45, respectivamente, y una puntuación de 1 ó 0 dependiendo de si la razón de los valores de ARNm de IL-10:IFN-γ está por encima o por debajo de 2,85, respectivamente, en el que una suma de 2 se correlaciona con alto riesgo de mortalidad debida a septicemia, una suma de 0 se correlaciona con un bajo riesgo de mortalidad debida a septicemia y 1 se correlaciona con un riesgo intermedio de muerte debida a septicemia.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para estratificar un paciente en un grupo con septicemia/sin septicemia, comprendiendo el procedimiento las etapas de determinar una razón de los valores de ARNm de IL-27:IL-23 en una muestra del paciente, en el que una razón mayor de 1,45 se correlaciona con el grupo con septicemia, y una razón menor de 1,45 se correlaciona con el grupo sin septicemia.
En los procedimientos de la invención, los valores de ARNm de IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ se representan de manera adecuada mediante los números de copias de ARNm de IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ, respectivamente, y en los que los números de copias se normalizan frente a un gen de mantenimiento. En una realización, el gen de mantenimiento es β-actina.
En una forma de realización preferida de la invención, las muestras del paciente humano son células mononucleares de una muestra de sangre periférica, o glóbulos blancos aislados de la capa leucocitaria de una muestra de sangre periférica.
En el procedimiento de la invención, preferiblemente se amplifica el ADN para IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ y se cuantifica como un sustituto para el número de copias de ARNm de IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ, respectiva- mente.
Normalmente, se mide el número de copias de ARNm de IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ en términos absolutos haciendo referencia a una curva de calibración construida a partir de muestra patrón de DIVA y normalizada con respecto a un gen de mantenimiento.
El ensayo de la presente invención puede utilizarse en el diseño de estudios farmacéuticos de pacientes con infección y/o septicemia, con el fin de estratificar los pacientes según la gravedad de la enfermedad, predecir el desenlace más probable y utilizar esta información en el diseño del estudio y el análisis posterior.
La predicción de la probabilidad de desarrollar septicemia grave, o choque septicémico o enfermedad crítica en respuesta a la infección, puede basarse en un análisis de regresión logística del ARNm de citocinas, con una estratificación del riesgo basada en las probabilidades relativas de desarrollar y no desarrollar enfermedad crítica (o septicemia, o septicemia grave o choque septicémico) en respuesta a la infección.
El riesgo de choque septicémico persistente frente al riesgo de resolución del choque septicémico puede basarse en un análisis de conglomerados.
Pueden utilizarse los niveles de ARNm para las citocinas enumeradas en la presente invención y/o las razones entre los diversos niveles de ARNm de citocinas, tal como se miden mediante PCR en tiempo real y se normalizan frente a un gen de mantenimiento y se calibran además frente a una curva de referencia derivada de un patrón de PCR de citocinas, distinto de los ya mencionados, en la predicción del desenlace en respuesta a la infección y el desenlace en pacientes con septicemia.
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para predecir una respuesta en pacientes humanos a una infección, comprendiendo el procedimiento determinar un valor de ARNm de IL-23 en una muestra del paciente, y correlacionar el valor con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección,
en el que un valor de ARNm de IL-23 bajo se correlaciona con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección, y un valor de ARNm de IL-23 alto se correlaciona con una probabilidad de que el paciente no desarrolle septicemia en respuesta a la infección.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra son células mononucleares de sangre periférica, en el que un valor de ARNm de IL-23 bajo se correlaciona con menos de 1824 copias de ARNm de IL-23 por 10 millones de copias de β-actina, y un valor de ARNm de IL-23 alto se correlaciona con 1824 o más copias de IL-23 por 10 millones de copias de beta-actina.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, y que predice además el resultado de la septicemia en un paciente, comprendiendo el procedimiento las etapas de determinar una razón de valores de ARNm de IL-27:IL-23 en una muestra del paciente, en el que una razón superior a 1,45 se correlaciona con la muerte y una razón inferior a 1,45 se correlaciona con la supervivencia.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, que incluye además determinar una razón de valores de ARNm de IL-10:IFN-γ en una muestra del paciente, en el que una razón superior a 2,85 se correlaciona con la muerte y una razón inferior a 2,85 se correlaciona con la supervivencia.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, que comprende un sistema de puntuación en el que se asigna a un paciente una puntuación de 1 ó 0 dependiendo de si la razón de valores de ARNm de IL-27:IL-23 está por encima o por debajo de 1,45, respectivamente, y una puntuación de 1 ó 0 dependiendo de si la razón de valores de ARNm de IL-10:IFN-γ está por encima o por debajo de 2,85, respectivamente, en el que una suma de 2 se correlaciona con un alto riesgo de mortalidad debida a septicemia, una suma de 0 se correlaciona con un bajo riesgo de mortalidad debida a septicemia y 1 se correlaciona con un riesgo intermedio de muerte debida a septicemia.
6. Procedimiento para estratificar un paciente en un grupo con septicemia/sin septicemia, comprendiendo el procedimiento las etapas de determinar una razón de valores de ARNm de IL-27:IL-23 en una muestra del paciente, en el que una razón superior a 1,45 se correlaciona con el grupo con septicemia, y una razón inferior a 1,45 se correlaciona con el grupo sin septicemia.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que los valores de ARNm de IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ se representan mediante los números de copias de ARNm de IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ, respectivamente, y en el que los números de copias se normalizan frente a un gen de mantenimiento.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el gen de mantenimiento es β-actina.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra son células mononucleares de una muestra de sangre periférica, o glóbulos blancos aislados en la capa leucocitaria de una muestra de sangre periférica.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se amplifica el ADNc para IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ y se cuantifica como un sustituto para el número de copias de ARNm de IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ, respectivamente.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se mide el número de copias de ARNm de IL-27, IL-23, IL-10 e IFN-γ en términos absolutos haciendo referencia a una curva de calibración construida a partir de una muestra patrón de ADN y normalizada con respecto a un gen de mantenimiento.
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