DESACOPLAMIENTO DE PROPAGACIÓN DEL ADN Y EXPRESIÓN DE PROTEÍNA PARA LA EXPRESIÓN EN FAGOS.

Un sistema de expresión que comprende un genoma modificado del fago T7 que comprende,

con una orientación 5' a 3', un promotor y/o una región reguladora ligados funcionalmente a una secuencia que codifica una proteína de la superficie del fago T7 ligada funcionalmente a una secuencia que comprende un codón de terminación ligado funcionalmente a una secuencia que codifica un polipéptido heterólogo; y una estructura artificial supresora que comprende, con una orientación 5' a 3', un promotor inducible y/o una región reguladora ligados funcionalmente a una secuencia que codifica un ARNt supresor que es complementario a dicho codón de terminación

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/024221.

Solicitante: AMBIT BIOSCIENCES CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 4215 SORRENTO VALLEY DRIVE SAN DIEGO, CA 92121 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: CICERI,PIETRO, ZARRINKAR,PATRICK,PARVIS, LOCKHART,DAVID,J, TREIBER,DANIEL,KELLY.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 1 de Agosto de 2003.

Fecha Concesión Europea: 6 de Octubre de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H21/04 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/10C1
  • C40B40/02 C […] › C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA.C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS, BIBLIOTECAS IN SILICO. › C40B 40/00 Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas. › Bibliotecas contenidas en o exhibidas por microorganismos, p. ej. bacterias o células animales; Bibliotecas contenidas en o exhibidas por vectores, p. ej. plásmidos; Bibliotecas que únicamente contienen microorganismos o vectores.

Clasificación PCT:

  • C12N15/62 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N15/86 C12N 15/00 […] › Vectores virales.

Clasificación antigua:

  • C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N15/09 C12N 15/00 […] › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N7/01 C12N […] › C12N 7/00 Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00). › Virus, p. ej. Bacteriófagos, modificados por la introducción de material genético externo (vectores C12N 15/00).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

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Fragmento de la descripción:

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una mejora en la tecnología de presentación en fagos (del inglés, “phage display”), basada en la expresión de una estructura artificial nucleico de ácido de fusión que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína del revestimiento del fago y un polipéptido heterólogo. La expresión de tal estructura artificial de ácido nucleico produce una proteína de fusión que se ensambla en una partícula del fago que propaga la estructura artificial y presenta el polipéptido heterólogo sobre la superficie de la partícula. La presente invención proporciona estructuras artificiales de ácido nucleico y métodos para su uso que se pueden utilizar para desacoplar la propagación de secuencias que codifican la proteína del revestimiento del fago y el polipéptido heterólogo, de la expresión y de la presentación del polipéptido heterólogo.

Técnica anterior

15 La presentación en fagos se conoce y se aplica extensamente en las ciencias biológicas y en la biotecnología (véanse los documentos de Patentes de EE.UU. 5.223.409; 5.403.484; 5.4571.698; 5.766.905; y las referencias citadas en los mismos). La metodología utiliza fusiones de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos externos de interés con secuencias que codifican proteínas del revestimiento del fago para presentar los polipéptidos externos en la superficie de las partículas del bacteriófago. Las aplicaciones de la tecnología incluyen el uso de interacciones de afinidad para seleccionar clones concretos a partir de una colección de polipéptidos, cuyos miembros se presentan en las superficies de partículas de fago individuales. La presentación de los polipéptidos se debe a la expresión de secuencias que los codifican

25 procedentes de vectores del fago, en los cuales se han insertado las secuencias. De este modo una colección de secuencias que codifican polipéptidos se transfiere a vectores individuales de presentación en fagos para formar una colección de fagos que se puede utilizar para escrutar los polipéptidos de interés. La presentación en fagos se ha empleado en una variedad de maneras y tam

30 bién se ha modificado para facilitar el aislamiento del polipéptido presentado. Ward y otros. (J. Imm. Meth. 189(1):73-82, 1996) describen la introducción de la secuencia que codifica un sitio de escisión enzimática entre las secuencias que codifican un polipéptido humano de IgG1 y un gen truncado del fago M13 Después de la expresión sobre la superficie del fago, el polipéptido se podía separar del fago mediante escisión enzimática.

La presentación en fagos basada en el bacteriófago filamentoso fd, también se ha modificado para utilizar secuencias que codifican un polipéptido heterólogo y una secuencia que codifica una proteína del fago, de modo que la expresión del polipéptido puede estar en forma soluble o como una fusión con la proteína del revestimiento del fago, dependiendo de la línea celular utilizada (véase, Hoogenboom y otros., Nucl. Acids Res. 19(15):4133-7, 1991, y Lucic y otros., J. Biotech. 61:95-108, 1998). Secuencias que se han modificado de forma semejante se han utilizado en sistemas de presentación basados en el bacteriófago º para expresar de forma condicionada los polipéptidos heterólogos sobre las cabezas del bacteriófago º (véase, Mikawa y otros,

10 J. Mol. Biol. 262: 21-30, 1996). Sin embargo, una limitación asociada con la presentación en fagos, es cuando la expresión de un polipéptido heterólogo afecta a la viabilidad de la célula hospedadora utilizada para propagar la fagoteca o utilizada para producir el fago para la presentación. Una aproximación para tratar esta limitación ha sido el uso de un promotor muy regulado para controlar la expresión de las fusiones de un polipéptido heterólogo y una proteína del revestimiento del fago, y controlar de este modo la presentación de las proteínas sobre el fago (véase, Huang y otros. Gene, 251:187-197, 2000). Sin embargo, esta aproximación no trata completamente una segunda dificultad, cuando la presencia de un polipéptido heterólogo en forma de una fusión con una proteína del revestimiento del fago, da como resultado una interferencia en el ciclo vital del fago. Una posible aproximación para tratar ambas interferencias en el ciclo vital del fago y los efectos negativos sobre la viabilidad de la célula hospedadora, es utilizar reguladores de la transcripción y/o de la traducción modificados, que disminuyen el nivel de expresión del polipéptido heterólogo.

25 La mención de documentos en esta memoria no pretende ser una admisión de que cualquiera se técnica anterior adecuada. Todas las declaraciones sobre la fecha o la representación en cuanto a los contenidos de estos documentos, se basan en la información disponible para el solicitante y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o de los contenidos de esos documentos.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona la capacidad de desacoplar la propagación y la expresión de la proteína de superficie del fago y del polipéptido heterólogo que están acoplados, durante la la puesta en práctica de la presentación en fagos. El desacoplamiento es controlable y proporciona la ventaja de ser capaz de propagar una estructura artificial de fusión para la presentación en el fago, sin la expresión del polipéptido heterólogo. En realizaciones preferentes, la propagación de una estructura artificial de fusión para la presentación en el fago se desacopla de la expresión del polipéptido heterólogo codificado.

5 La invención proporciona en general la propagación de una estructura artificial para la presentación en fagos bajo dos condiciones en relación con la expresión de la proteína de la superficie del fago y del polipéptido heterólogo. La primera condición es la propagación del ácido nucleico, mediante la encapsidación de la estructura artificial en una partícula del fago, en presencia de la proteína de la superficie del fago expresada y en ausencia del polipéptido heterólogo expresado. La segunda condición es la propagación del ácido nucleico en presencia de la proteína de la superficie del fago expresada y del polipéptido heterólogo expresado como una proteína de fusión. La última de estas dos condiciones es en donde el fago encapsidado se puede utilizar para la de presentación en el fago. Las estructuras artificiales preferidas para la puesta en práctica de la invención bajo estas condiciones, son estructuras artificiales basadas en el genoma del fago que requieren la producción del fago para la propagación de las secuencias de ácido nucleico codificadas por el fago.

La capacidad de desacoplar la propagación de la expresión del polipéptido heterólogo es un aspecto de la invención que idealmente es adecuado para situacio20 nes en las que la expresión del polipéptido heterólogo puede ser tóxica para la célula hospedadora o perjudicial para el ciclo vital normal del fago. En otro aspecto, la invención también permite desacoplar de forma controlada la expresión de la proteína de la superficie del fago, de la expresión del polipéptido heterólogo. Esto es una ventaja particular en situaciones en las que la expresión del polipéptido heterólogo afecta ne25 gativamente al crecimiento o a la viabilidad de la célula hospedadora o a la producción de partículas de fago viables. Un efecto beneficioso adicional es que una colección de secuencias que codifican los polipéptidos heterólogos en los fagos de la invención se puede propagar o mantener sin pérdida de complejidad (o representación de secuencias individuales) debido a los efectos perjudiciales procedentes de la expresión de

30 algunas secuencias. La presente invención también permite de forma ventajosa el uso de secuencias reguladoras no modificadas que controlan la transcripción y/o la traducción, para permitir un alto nivel de expresión de la proteína de la superficie del fago, opcional-mente como una fusión con el polipéptido heterólogo para la presentación en fagos. Con otras palabras, la capacidad de desacoplar la expresión de la proteína de la superficie del fago del polipéptido heterólogo permite el uso de promotores no atenuados y señales de traducción (p. ej., sitios de unión al ribosoma y/o de entrada) sin efectos negativos significativos sobre la propagación del fago o la viabilidad de la célula hospedadora. Alternativamente, la invención se puede poner en práctica con secuencias reguladoras...

 


Reivindicaciones:

1. Un sistema de expresión que comprende

5 un genoma modificado del fago T7 que comprende, con una orientación 5' a 3', un promotor y/o una región reguladora ligados funcionalmente a una secuencia que codifica una proteína de la superficie del fago T7 ligada funcionalmente a una secuencia que comprende un codón de terminación ligado funcionalmente a una secuencia que codifica un polipéptido heterólogo; y

10 una estructura artificial supresora que comprende, con una orientación 5' a 3', un promotor inducible y/o una región reguladora ligados funcionalmente a una secuencia que codifica un ARNt supresor que es complementario a dicho codón de terminación.

15 2. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho promotor y/o dicha región reguladora son endógenos en un genoma del fago T7.

3. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho promotor y/o dicha región reguladora son un promotor de T7.

4. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho promotor inducible y/o región reguladora son el promotor BAD inducible con arabinosa y el gen regulador araC.

25 5. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia que comprende un codón de terminación comprende adicionalmente una secuencia que codifica un sitio de escisión enzimática.

6. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicha proteína de la su30 perficie del fago T7 es una proteína del revestimiento del fago T7.

7. El sistema según la reivindicación 6, en donde la proteína del revestimiento del fago T7 está codificada por el gen 10.

35 8. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicha estructura artificial supresora comprende adicionalmente una secuencia que se puede expresar que codifica la resistencia al cloranfenicol.

9. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho codón de termina5 ción se selecciona entre UAG, UAA y UGA.

10. El sistema según la reivindicación 9, en donde dicho codón de terminación es UAG.

10 11. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho ARNt supresor es ARNtAla o ARNtGlu .

12. Un método para identificar un polipéptido que interacciona con un compuesto de la prueba que comprende

15 introducir el sistema según la reivindicación 1 o el sistema según la reivindicación 3 o el sistema según la reivindicación 4 o el sistema según la reivindicación 6, en una célula e inducir la expresión de dicha secuencia que codifica un polipéptido heterólogo y permitir que dicho polipéptido se presente en la superficie de las partículas del fago producidas por dicha célula;

20 poner en contacto dichas partículas del fago con dicho compuesto de la prueba; e

identificar dicho polipéptido como el que interacciona con dicho compuesto de la prueba detectando la interacción de las partículas del fago con dicho compuesto de la prueba debido a la presentación de dicho polipéptido.

13. El método según la reivindicación 12, en donde dicho sistema es un sistema de acuerdo con la reivindicación 1 y dicha célula es una célula de E. coli.

14. El método según la reivindicación 13, en donde dicha célula es un deri30 vado de BL21, opcionalmente en donde dicha célula es BLT5615.

15. Un método para identificar un polipéptido que interacciona con un compuesto de la prueba que comprende

introducir el sistema según la reivindicación 1, en donde dicho codón de termi35 nación es UAG y dicho ARNt supresor es ARNtAla , en una célula e inducir la expresión de dicha secuencia que codifica un polipéptido heterólogo y permitir que dicho polipéptido esté presente en la superficie de las partículas del fago producidas por dicha célula;

poner en contacto dichas partículas del fago con dicho compuesto de la prue5 ba; e

identificar dichos polipéptidos como los que interaccionan con dicho compuesto de la prueba detectando la interacción de las partículas del fago con dicho compuesto de la prueba debido a la presentación de dicho polipéptido.

10 16. El método según la reivindicación 12 o la reivindicación 15, que comprende adicionalmente aislar la secuencia que codifica dicho polipéptido, opcionalmente en donde dicho aislamiento se realiza mediante la subclonación directa de dicha secuencia que codifica dicho polipéptido dentro de otra molécula de ácido nucleico, preferentemente en donde dicho aislamiento se realiza mediante amplificación con la

15 PCR.

17. Un vector para emplear en el sistema de expresión según la reivindicación 1, que comprende un genoma del fago T7 modificado que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos que están ligados fun

20 cionalmente, con una orientación 5' a 3': (1) una secuencia de ácido nucleico del gen 10 que codifica una proteína del revestimiento de T7, (2) un codón de terminación dentro de la fase, y (3) un sitio de clonación para la inserción, dentro de la fase, de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, en donde la expresión del polipéptido heterólogo está condicionada a la expresión del ARNt supresor.

18. El vector según la reivindicación 17, que comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico del promotor de T7 de tipo silvestre, ligada funcionalmente en 5' a dicha secuencia de ácido nucleico del gen 10.

30 19. El vector según la reivindicación 18, que comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico de Shine-Dalgarno de T7 de tipo silvestre, ligada funcionalmente en 3' a dicha secuencia de ácido nucleico del promotor de T7 y en 5' a dicha secuencia de ácido nucleico del gen 10.

35 20. El vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un enlazador dentro de la fase, ligado funcionalmente en 3' a dicho codón de terminación y en 5' a dicho sitio de clonación.

21. El vector según la reivindicación 20, en donde dicho enlazador comprende un sitio de escisión enzimática.

22. El vector según la reivindicación 21, en donde dicho sitio de escisión

enzimática está reconocido y es cortado por la proteasa del virus del grabado del ta10 baco (VGT).

23. El vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, que comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico dentro de la fase que codifica un polipéptido heterólogo ligado funcionalmente en 3' a dicho codón de termina

15 ción.

24. El vector según la reivindicación 23, en donde el polipéptido heterólogo es una cinasa de proteína.

20 25. Un fago T7 modificado que comprende el vector según la reivindicación

19.

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