CONSTRUCCIONES PARA LA EXPRESIÓN INDUCIBLE DE ARN DE INTERFERENCIA PEQUEÑO (ARNS) PARA EL SILENCIAMIENTO GÉNICO SELECCIONADO.

Un vector recombinante para la expresión regulable de una molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria en una célula eucariota,

que comprende al menos una secuencia que codifica la molécula de ARN ligada operativamente a una secuencia de control de la expresión que comprende un promotor de ARN polimerasa III y varios sitios de unión a proteína represora, en el que al menos un sitio de unión a proteína represora está situado 5', y un sitio de unión a proteína represora está situado 3' con respecto a la caja TATA del promotor de ARN polimerasa 5 III

La invención se refiere a vectores para la expresión inducible de moléculas de ARN en células y organismos eucariotas, particularmente de mamíferos. 5

Se ha demostrado que los ARN bicatenarios pequeños de aproximadamente 20 a 30 pares de bases dirigen de una forma específica de la secuencia la degradación de ARNm en células de mamíferos (McManus y Sharp 2002). Estos ARN de interferencia pequeños (ARNsi) tienen preferentemente una longitud de 21 nucleótidos (nt), y están emparejados de manera que tienen un tallo de 19 pares de bases y extremos salientes en 3' con dos nt (Elbashir et al. 2001b; Elbashir et al. 2001a; Elbashir et al. 2001c; Elbashir et al. 2002). Tales dúplex de ARNsi se 10 pueden suministrar a células de mamíferos mediante microinyección, transfección o electroporación, y se pueden convertir en una nueva clase de agentes terapéuticos dirigidos contra genes que se han asociado con patogénesis, tales como genes víricos, destruyendo sus ARNm y evitando de ese modo su expresión (Paddison y Hannon 2002; Tuschl y Borkhardt 2002). El ARN bicatenario más largo de 30 pares de bases puede activar la respuesta de interferón, provocando la detención traduccional no específica y la apoptosis; estos efectos no se han observado con 15 los ARNds más cortos (Bitko y Barik 2001; Elbashir et al. 2001b).

Más recientemente, se descubrió una nueva clase de genes que codifican bucles de horquilla de ARNds corto, de alrededor de 25 a 30 pares de bases de longitud, que se procesan en ARN pequeños de 21 a 23 nucleótidos (Lagos-Quintana et al. 2001; Lau et al. 2001; Lee y Ambros 2001; Lagos-Quintana et al. 2002). Esta clase se denominó los microARN. Los microARN funcionan en la misma ruta que los ARNsi, asociándose con las 20 proteínas Argonauta, que son necesarias para guiar el reconocimiento del ARNm diana (Hutvágner y Zamore 2002; Martinez et al. 2002; Mourelatos et al. 2002). Los miARN escinden ARNm diana complementarios en plantas (Llave et al. 2002; Rhoades et al. 2002), pero parece que reprimen la traducción de ARNm en lugar de la escisión del ARNm en animales (Hutvágner y Zamore 2002).

Para experimentos de selección de dianas génicas, hasta hace poco se introdujeron ARNsi en células vía 25 métodos de transferencia génica clásicos, tales como transfección mediada por liposomas, electroporación, o microinyección, que requieren la síntesis química o enzimática de los ARNsi antes de su aplicación; pero los ARNsi también se pueden generar intracelularmente mediante expresión de los ARNsi a partir de ADN plasmídico o constructos retrovíricos, lentivíricos o adenovíricos (Barton y Medzhitov 2002; Brummelkamp et al. 2002a; Brummelkamp et al. 2002b; Devroe y Silver 2002; McManus et al. 2002; Miyagishi y Taira 2002; Xia et al. 2002; 30 Zeng et al. 2002). La transcripción intracelular de moléculas de ARN pequeñas es posible clonando los moldes de ARNsi en unidades de transcripción de ARN polimerasa III (pol III), que normalmente codifican el ARN nuclear pequeño U6 o el resto de ARN H1 de la ARNasa P humana. Se han desarrollado dos enfoques para expresar los ARNsi: (1) las hebras sentido y antisentido que constituyen el dúplex de ARNsi son transcritas por promotores individuales (Lee et al. 2002; Miyagishi y Taira 2002), o (2) los ARNsi son expresados como estructuras de tallo-35 bucle plegadas hacia atrás que dan lugar a los ARNsi tras el procesamiento intracelular (Brummelkamp et al. 2002b; Paul et al. 2002). Se piensa que la expresión endógena de los ARNsi a partir de moldes de ADN introducidos supera algunas limitaciones del suministro de ARNsi exógeno, en particular la pérdida transitoria de fenotipo.

Los promotores de ARN U6 y H1 son miembros del tipo III de promotores de pol III (Paule y White 2000). Estos promotores son inusuales por cuanto casi todos sus elementos, con la excepción del primer nucleótido 40 transcrito (posición + 1), están localizados en dirección 5' de la región transcrita, de forma que se puede transcribir casi cualquier secuencia insertada más corta de 400 nt. Por lo tanto, son muy adecuados para la expresión de los ARNsi de aproximadamente 21 nt o los tallo-bucles de ARN de aproximadamente 50 nt. El promotor U6 y el promotor H1 tienen un tamaño diferente, pero contienen los mismos elementos de secuencia conservados o sitios de unión a proteínas (Myslinski et al. 2001). El nucleótido en + 1 de los promotores similares a U6 es siempre 45 guanosina, y siempre adenosina para H1. De forma interesante, el cambio de la adenosina en + 1 por U, C o G en las secuencias de tallo-bucle expresadas por H1 no parece afectar al silenciamiento génico, sugiriendo por lo tanto que los promotores H1 pueden ser más flexibles que los promotores U6 para los cambios de secuencia en + 1, o pueden ser capaces de iniciar la transcripción en el primer nucleótido de purina en dirección 3' codificado por el ADN molde (Brummelkamp et al. 2002b). La transcripción del ARN termina cuando pol III encuentra un tramo de 4 ó 5 50 timidinas después de la incorporación de varios restos de uridina (Myslinski et al. 2001).

Sin embargo, para aplicaciones prácticas, también se deben de considerar el tiempo extra considerable implicado en preparar y amplificar vectores de expresión de ARNsi y la eficiencia de la transfección de plásmidos, con relación a los ARNsi. Adicionalmente, la selección como dianas de genes esenciales provoca la detención en el crecimiento celular o la muerte celular en uno a tres días después del suministro de los ARNsi, haciendo así 55 innecesario el silenciamiento a largo plazo, si no imposible; sin embargo, el desarrollo de sistemas de expresión inducible de ARNsi puede proporcionar una alternativa interesante en tales casos (Ohkawa y Taira 2000). Sin embargo, cuando se seleccionan como dianas proteínas no esenciales, las células estables a las que se les ha reducido la expresión de algún gen (células knockdown) pueden ser de gran valor cuando se estudian procesos inducibles tales como la respuesta al daño por irradiación con UV, interacciones hospedante-patógeno, o 60

diferenciación celular. A fin de superar la limitación de los vectores actualmente disponibles seleccionadores de dianas, se ha explorado la posibilidad de insertar secuencias de unión a proteínas reguladoras en la región promotora de promotores de pol III.

Un primer aspecto de la presente invención es un vector recombinante para la expresión inducible de una molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria en una célula eucariota, particularmente de mamífero, que 5 comprende al menos una secuencia que codifica la molécula de ARN ligada operativamente a una secuencia de control de la expresión que comprende un promotor de polimerasa III y varios sitios de unión a proteínas reguladoras, y opcionalmente un terminador de la transcripción, en el que al menos un sitio de unión a proteínas reguladoras está localizado en 5', y un sitio de unión a proteínas reguladoras está localizado en 3' con respecto a la caja TATA del promotor de polimerasa III, y en el que los sitios de unión a proteínas reguladoras son sitios de unión 10 para una proteína represora. El promotor de polimerasa III y los sitios de unión a proteínas reguladoras están localizados en 5' con respecto a la secuencia codificante, y el terminador está localizado en 3' con respecto a la secuencia codificante.

El vector puede ser cualquier vector que sea adecuado para la transfección de células eucariotas, por ejemplo un vector de ADN o de ARN. El vector puede ser un plásmido, por ejemplo un plásmido lineal o circular, un 15 cósmido, un vector vírico, por ejemplo un adenovirus, un retrovirus, un virus adenoasociado, un virus de la vacuna, un lentivirus o un cromosoma artificial. El vector puede ser un vector extracromosómico, o un vector que es capaz de integrarse en el genoma de una célula hospedante. Los vectores apropiados son bien conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1998), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, y en Ausubel et al. (1998), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, por ejemplo. 20

La molécula de ARN que está siendo expresada por el vector puede ser cualquier molécula de ARN que tenga una longitud de 15-500 nucleótidos, preferiblemente de 20-400 nucleótidos. Por ejemplo, el ARN puede ser un ARNt, un ARNsn o un microARN. Sin embargo, preferiblemente, el ARN es una molécula de ARN que es capaz de producir la interferencia del ARN, o una molécula que se procesa, por ejemplo mediante mecanismos celulares, para proporcionar una molécula que es capaz de producir la interferencia del ARN. En... [Seguir leyendo]

1. Un vector recombinante para la expresión regulable de una molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria en una célula eucariota, que comprende al menos una secuencia que codifica la molécula de ARN ligada operativamente a una secuencia de control de la expresión que comprende un promotor de ARN polimerasa III y varios sitios de unión a proteína represora, en el que al menos un sitio de unión a proteína represora está situado 5', y un sitio de unión a proteína represora está situado 3' con respecto a la caja TATA del promotor de ARN polimerasa 5 III.

2. El vector de la reivindicación 1, en el que la molécula de ARN codificada es capaz de provocar la interferencia del ARN, o se procesa para proporcionar una molécula de ARN capaz de provocar la interferencia del ARN.

3. El vector de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la molécula de ARN es monocatenaria. 10

4. El vector de la reivindicación 3, en el que la molécula de ARN tiene una longitud de 30-100 nucleótidos.

5. El vector de la reivindicación 3 ó 4, en el que la molécula de ARN tiene una porción que es al menos sustancialmente complementaria a un transcrito diana.

6. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que la molécula de ARN es capaz 15 de formar una estructura de horquilla.

7. El vector de la reivindicación 6, en el que la estructura de horquilla tiene un saliente en 3'.

8. El vector de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la molécula de ARN es bicatenaria.

9. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el promotor de polimerasa III es un promotor H1. 20

10. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que los sitios de unión a proteína reguladora son sitios de unión para el represor de tetraciclina.

11. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la secuencia de control de la expresión comprende además un terminador de la transcripción.

12. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la inhibición de la expresión de 25 un gen diana in vitro.

13. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la inhibición de la expresión de un gen diana in vivo.

14. Una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ARN vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 como ingrediente activo, y vehículos, diluyentes y/o excipientes 30 farmacéuticamente aceptables.

15. La composición de la reivindicación 14, que es una formulación liposómica o lipídica catiónica.

16. La composición de las reivindicaciones 14 ó 15, para aplicaciones de diagnóstico.

17. La composición de la reivindicación 16, para monitorizar enfermedades asociadas con la sobreexpresión de al menos un gen diana. 35

18. La composición de las reivindicaciones 14 ó 15, para aplicaciones terapéuticas.

19. La composición de la reivindicación 18, para la prevención o tratamiento de enfermedades asociadas con la sobreexpresión de al menos un gen diana.

20. La composición de las reivindicaciones 17 ó 19, en la que las enfermedades se seleccionan de enfermedades tumorales, enfermedades inflamatorias, enfermedades infecciosas, por ejemplo infecciones víricas, 40 enfermedades degenerativas y enfermedades autoinmunitarias.

21. Una célula eucariota que se transfecta con un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

22. La célula de la reivindicación 21, que es una célula de mamífero.

23. La célula de la reivindicación 22, que es una célula humana. 45

24. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 21-22, que se transfecta de forma estable.

25. Una población celular clonal derivada de una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 21-24.

26. La población celular de la reivindicación 25, que consiste en células transfectadas.

27. Un animal transgénico no humano que se transfecta con un vector de una cualquiera de las 5 reivindicaciones 1-13.

28. El animal no humano de la reivindicación 27, que es un mamífero.