PROCEDIMIENTO Y COMPOSICIONES PARA REDUCIR LAS CANTIDADES DE GENOMA VIRAL DE VHC EN UNA CÉLULA DIANA.

Un agente inhibidor de miR122, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC,

en el que dicho agente es un oligonucleótido antisentido o un agente de ARNi

Introducción

Antecedentes de la invención

Las infecciones virales son un problema medico continuo debido a que, como cualquier agente infeccioso que se divide rápidamente, existen mutaciones continuas que ayudan a algunas subpoblaciones de virus a continuar siendo resistentes a los regímenes de tratamiento actuales. Muchas enfermedades basadas en virus no tienen tratamientos antivirales eficaces, debido a que tales tratamientos se dirigen a los síntomas de la enfermedad viral y no la causa raíz de la enfermedad. Existe una necesidad en la técnica de descubrir y desarrollar terapias antivirales.

Los MicroARN (miARN) son una clase de pequeñas moléculas de ARN, de aproximadamente 21 -22 nts de longitud, que se han detectado en muchas especies de plantas y animales. Incluso ciertos genomas de ARN viral se han encontrado que codifican ARNmi. Los esfuerzos de clonación y predicciones de ordenador han indicado que existen probablemente sobre 200 genes que codifican en seres humanos, que pueden regular aproximadamente 1000 -2000 ARNm. Ciertos ARNmi se expresan de manera ubicua, mientras que otros se expresan de una manera altamente específica en tejidos. Por ejemplo, miR-122 se observó que se expresaba de manera específica en el hígado, donde constituye el 70 % de la población total de ARNmi.

Bibliografía Relevante

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El documento WO 02/081494 se refiere a moléculas de ácido nucleico antisentido que modulan la síntesis, expresión y / o estabilidad de VHC o HBV. McCaffrey, A. et al., Nature, 418 (6893), páginas 38 -39, se refiere a la fijación como diana de una secuencia del virus de hepatitis C por interferencia de ARN en ratones.

Sumario de la invención

La invención proporciona agentes inhibidores de miR122 para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en la que dicho agente es un oligonucleótido antisentido o un agente de ARNi. Otros aspectos de la invención se definen en las reivindicaciones.

Procedimientos y composiciones para reducir cantidades de genoma viral en una célula diana se describen en el presente documento en los procedimientos presentes, la actividad de un ARNmi se inhibe de una manera suficiente para reducir la cantidad de genoma viral en la célula diana, por ejemplo, mediante la inhibición de un agente inhibidor de ARNmi en la célula diana. También se proporcionan composiciones farmacéuticas, kits y sistemas para uso en la práctica de los procedimientos presentes. La invención sujeto encuentra uso en una diversidad de aplicaciones, incluyendo el tratamiento de sujetos que padecen de una afección patológica mediada por virus, por ejemplo, una afección patológica mediada por VHC.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1C. miR-122 se expresa en células Huh7 y tiene dos sitios de unión predichos en el genoma de VHC.

(A) análisis de transferencia de Northern de la expresión de miR-122 en el ARn total extraído de hígado de ratón y humano, y células HeLa, HepG2 y no expuestas, curadas y Huh7 de replicón. (B) Secuencia de miR-122 con las secuencias de siembra rodeadas por una caja. (C) Estructura secundaria de las regiones antisentido de 3' y 5' del genotipo 1 de VHC una cepa H77c, con sitios de unión de miR-122 predichos. La parejas de siembra están encerradas en cajas.

Figuras 2A-C. El secuestro de miR-122 reduce la abundancia de ARN y proteína de VHC en células de replicón. (A) análisis de transferencia de Northern de replicón, ARN de eGFP y actina en la línea celular de replicón NNeo/C-5B. La organización del replicón está indicada. Los plásmidos sensores de eGFP y los oligonucleótidos 2'-O-metil se introdujeron en las células por transfección mediada por lipofectamina 2000, y se extrajo ARN total 48 horas después, eGFP-124 y eGFP-122 son vectores de expresión de eGFP con sitios complementarios para miR-124 y miR-122, respectivamente, en el 3'UTR. 122-2'OMe es un oligómero de 31 mer 2'-O-metilado complementario a miR-122, Rand-2'OMe es una versión aleatoria de de esta secuencia, y let7-2'OMe es un oligómero similar complementario a let-7a. (B) Transferencia de Western que muestra los niveles de proteína del núcleo de VHC, eGFP y actina 48 horas después de la transfección con los plásmidos sensores de eGFP indicados y oligómeros 2'-O-metilados. (C) Análisis de Northern de replicón, ARN de eGFP y actina en células Huh7 que contienen el replicón H77c de genotipo 1a de longitud de genoma transfectado con eGFP-122 y 122-2'OMe.

Figuras 3A-3C. El sitio de unión a miR-122 predicho en la región antisentido de 5' de VHC se requiere para el mantenimiento de ARN viral debido a una interacción directa con miR-122 (A) Posición de las mutaciones introducidas en el ARN de longitud completa de H77c. Se introdujo una mutación por sustitución de 4nt dentro del emparejamiento de siembra en la región antisentido de 3' (m3') y mutaciones por sustitución de 4nt, 2nt o 1 nt en el emparejamiento de siembra de la región antisentido de 5' (m5'A, B y C respectivamente). Los nucleótidos mutados están encerrados en cajas. (B) ARN se sintetizó por transcripción in vitro y se introdujo en células Huh7 por electroporación, y se determinaron los niveles de ARN de replicón mediante transferencia de Northern 5 días después. Se muestra la tinción con azul de metileno de ARN ribosómico como un control de carga. (C) Se transfectaron células Huh7 con sintéticos dobles transfectados con dobles sintéticos correspondientes a miR-122 de tipo salvaje (122wt) o miR-122 con una mutación de 1 nt en la siembra complementaria a la mutación de emparejamiento de siembra m5'C (122mC), la hebra opuesta del doble basada en la horquilla precursora de miR-122. Los dobles se introdujeron en células Huh7 un día antes de la electroporación con ARN de H77c de tipo salvaje o ARN de m5'C mutantes, y de nuevo 1 y 3 días después de la electroporación. Se recogió el ARN total 5 días después de la electroporación y se determinaron los niveels de ARN de replicón y actina por transferencia de Northem.

Figura 4 Mutación del sitio de unión a miR-o afecta a la traducción de ARNm de VHC. La mutación m5'C se introdujo en un mutante deficiente en replicación de H77c, AAG-H77, que contiene los cambios de aminoácidos GDD a AAG en las posiciones 2737 a 2739 en la polimerasa viral NS5B (23). Se recogieron los lisados 20 horas después transfección del ARN de replicón, y proteína del núcleo de VHC y expresión de actina determinada por transferencia de Western.

Figura S3A y B adición de doble de miR-122 sintético a células de replicón de NNeo/C-5B da como resultado un incremento en la abundancia de ARN de replicón. Los plásmidos sensores de eGFP indicados y dobles de miR-122 de tipo salvaje (122wt) o mutante (122mC) se introdujeron en las células por transfección usando lipofectamina 2000. Total

Descripción de las realizaciones específicas

Se describen procedimientos y composiciones para reducir cantidades de genoma viral en una célula diana. En los procedimientos presentes, la actividad de un ARNmi se inhibe de una manera suficiente para reducir la cantidad de genoma viral en la célula diana, por ejemplo, mediante la introducción de un agente inhibidor de ARNmi en la célula diana. También se proporcionan composiciones farmacéuticas, kits y sistemas para uso en la práctica de procedimientos presentes. La invención sujeto encuentra uso en una diversidad de aplicaciones, incluyendo el tratamiento de sujetos que padecen una afección patológica mediada por virus, por ejemplo, una afección patológica mediada por VHC.

1. Un agente inhibidor de miR122, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho agente es un oligonucleótido antisentido o un agente de ARNi.

2. El agente de la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho oligonucleótido antisentido comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID Neo: 15 o SEQ ID NO: 18.

3. El agente de la reivindicación 2, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho oligonucleótido antisentido consta de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 18.

4. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido de ARN 2'O-metilado.

5. El agente de cualquier reivindicación precedente, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho huésped es un ser humano.

6. El agente de cualquier reivindicación precedente, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en asociación o en combinación con otro compuesto farmacéuticamente activo.

7. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en combinación y / o alternancia con otros agentes terapéuticos o agentes antivirales profilácticos.

8. El agente de la reivindicación 7, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en combinación con un agente anti-VHC.

9. El agente de la reivindicación 8, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho agente anti-VHC se selecciona entre interferones, inhibidores de la replicación de ARN, agentes antisentido, vacunas terapéuticas, inhibidores de proteasa, inhibidores de helicasa y terapia de anticuerpos.

10. El agente de la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho agente anti-VHC es un interferón.

11. El agente de la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho agente anti-VHC es un inhibidor de la replicación de ARN.

12. El agente de la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho agente anti-VHC es un inhibidor de proteasa.

13. El agente de la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho agente anti-VHC es un inhibidor de helicasa.

14. Uso de un agente inhibidor de miR122 tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -13 en la preparación de un medicamento para tratar a un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC.

15. Un procedimiento in vitro de modulación de una cantidad de genoma de un virus de Hepatitis C en una célula diana, comprendiendo dicho procedimiento la inhibición de la actividad de miR122 en dicha célula diana mediante la introducción en dicha célula diana de un agente inhibidor de miR122 tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.