Un procedimiento para preparar una nanopartícula de quitosana/ARNip que comprende las etapas de:

a. Proporcionar una solución de quitosana b. Proporcionar una solución de ARNip c. Mezclar la solución de la etapa a con la solución de la etapa b d. Incubar la solución de la etapa c en condiciones de formación de complejos de modo que se formen nanopartículas de quitosana/ARNip - en el que la nanopartícula de quitosana/ARNip no comprende un reticulante inicial y - en el que el peso molecular de la quitosana es mayor de 10 kDa y - en el que la quitosana tiene un grado de desacetilación de al menos el 60%

Antecedentes

La administración de ácidos nucleicos en células diana es de interés por diversas razones. Por ejemplo, el uso de plásmidos de expresión y moléculas antisentido como fármacos de terapia génica ha estado impedido por malas técnicas de administración. Además, una técnica de administración mejorada podría expandir el uso de los llamados aptámeros, para incluir también dianas celulares. Los aptámeros son ácidos nucleicos que se pliegan en una estructura tridimensional que les permite interaccionar con moléculas diana con elevada afinidad y especificidad.

Otra clase de ácidos nucleicos que ha traído una atención masiva recientemente son los ARN interferentes pequeños y los microARN. Estos complejos de ARN bicatenarios pueden mediar diversas modificaciones de ácidos nucleicos diana en la célula. En este proceso, la cadena antisentido del complejo actúa como guía, ya que la cadena antisentido puede hibridar con ácidos nucleico diana que tienen tramos de complementariedad de secuencia con la cadena antisentido.

La eliminación mediada por ARN de la expresión proteica a nivel de ARN mensajero (ARNm) ofrece una nueva estrategia terapéutica para superar enfermedades. El proceso por el cual el ARN interferente pequeño (ARNip) modula la escisión inducida enzimáticamente del ARNm homólogo y la interrupción concomitante de la expresión génica (interferencia de ARN) se ha estudia extensivamente como una herramienta para investigar los procesos celulares en células de mamífero. La interferencia de ARN se ha demostrado usando ARNip dirigido contra genes responsables de patogénesis vírica, cáncer y afecciones inflamatorias. Como consecuencia, la posibilidad de silenciar genes implicados en enfermedades usando ARNip ha conducido a una rápida evolución en el área del descubrimiento de fármacos.

Las moléculas de ARN también pueden incluir el silenciamiento transcripcional. El silenciamiento transcripcional inducido por ARN es una forma de interferencia de ARN por el cual moléculas cortas de ARN - microARN (miARM) o ARN interferente pequeño (ARNip) - desencadenan la regulación negativa de la transcripción de un gen particular o región genómica. Esto se consigue habitualmente por modificación de histonas, a menudo por metilación, o por la inducción de formación de heterocromatina.

La eficacia de un fármaco se determina por la capacidad de migrar a través del cuerpo y alcanzar sitios diana a niveles terapéuticamente relevantes. La inyección de ARNip desnudo en ratones ha provocado una eliminación génica localizada. Un inconveniente, sin embargo, es el requisito de elevadas dosis debido a la inestabilidad del ARN y la captación celular no específica e impracticabilidad de este procedimiento para uso humano. Se han desarrollado sistemas de administración virales y no virales para superar las barreras extracelulares e intracelulares que restringen el uso terapéutico de fármacos basados en ácido nucleico.

Las nanopartículas de polielectrolito formadas por el autoensamblaje de ADN plasmídico con policationes, ampliamente usado en administración génica, se han adoptado para el uso de ARNip. Los vectores de polímero catiónico y ARNip basado en lípidos han demostrado entrar en las células y mediar la interferencia de ARN específica in vitro e in vivo. La eficacia de los sistemas de nanopartículas está limitada por la rápida eliminación de la circulación por la captura de células fagocíticas mononucleares o por interacciones catiónicas no específicas con membranas biológicas y tejido conectivo. Un enfoque alternativo para la administración de fármacos tanto local como sistémico es la explotación de las vías mucosas, por ejemplo, nasal, para evitar el mecanismo de eliminación hepática del primer paso asociado con administración intravenosa. El polisacárido quitosana, usado satisfactoriamente para la administración de fármacos nasales debido a sus propiedades mucoadhesivas y de permeación en la mucosa, se ha utilizado en la formación de nanopartículas de polielectrolitos que contienen plásmidos para la expresión génica en sitios respiratorios y tejido sistémico.

El documento WO03092739 desvela un procedimiento para producir un complejo de quitosana y ácido nucleico. Los

45 oligómeros catiónicos usados en la producción tiene un peso molecular entre 500 y 10.000 Da, y el ácido nucleico se selecciona entre el grupo que consiste en ARN y ADN.

El documento WO 2005/113770 desvela nanopartículas revestidas con quitosana cargadas con ARNip anti-RhoA administrado por vía IV. El peso molecular de la quitosana en las nanopartículas varía de 2000 a 8000 Da.

El documento WO 03/030941 desvela la preparación de una composición impregnando partículas de quitosana con una solución concentrada de ASO, y después por secado rápido de modo que suceda la unión del ADN o ARN a la quitosana.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al campo de ácidos nucleicos y su administración en células. En particular, la invención se refiere a nanopartículas que comprenden moléculas de ARNip y procedimientos para la preparación de dichas nanopartículas usando quitosana. Son de interés porque pueden usarse en investigación básica y potencialmente como medicamentos.

Descripción detallada de la invención

El término quitosana como se usa en este documento tiene el mismo significado que el general en la técnica. Es decir, quitosana se refiere a un polisacárido lineal compuesto por D-glucosamina -(1-4)-enlazada (unidad desacetilada) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilada) distribuidas aleatoriamente. La quitosana se produce típicamente por desacetilación de quitina, que es el elemento estructural en el exoesqueleto de crustáceos (cangrejos, camarones, etc.). El grado desacetilación en quitosanas comerciales está en el intervalo del 60-100%.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una nanopartícula para la administración de moléculas de ARNip, en particular moléculas de ARNip que son capaces de modular la expresión génica u otras actividades bioquímicas en la célula.

Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar una nanopartícula de ARNip y quitosana que comprende las etapas de:

a. Proporcionar una solución de quitosana

b. Proporcionar una solución de ARNip

c. Mezclar la solución de la etapa a con la solución de la etapa b

d. Incubar la solución de la etapa c en condiciones de formación de complejos de modo que las nanopartículas de quitosana/ARNip formen una solución de ARNip, donde las nanopartículas de quitosana/ARNip no comprenden un reticulante inicial, y donde el peso molecular de la quitosana es de más de 10 kDa y, donde la quitosana tiene un grado de desacetilación de al menos el 60%.

En una realización preferida de la invención, la solución de ARNip comprende moléculas de ARNip de una longitud de menos de 100 nucleótidos. En otras realizaciones, las moléculas de ARNip son de una longitud de menos de 90 nucleótidos, de menos de 80 nucleótidos, de menos de 70 nucleótidos, de menos de 60 nucleótidos, de menos de 50 nucleótidos, de menos de 40 nucleótidos, de menos de 30 nucleótidos y de menos de 22 nucleótidos, respectivamente.

En una realización preferida de la invención, la solución de ARNip comprende complejos de ARNip de una o más moléculas de ARNip, donde la cantidad total de nucleótidos en el complejo de ARNip es de menos de 100 nucleótidos. En otras realizaciones, la cantidad total de nucleótidos es de menos de 90 nucleótidos, de menos de 80 nucleótidos, de menos de 70 nucleótidos, de menos de 60 nucleótidos, de menos de 50 nucleótidos, de menos de 40 nucleótidos y de menos de 30 nucleótidos, respectivamente.

Moléculas de ARN y complejos

Una molécula de ARNip como se usa en este documento es un tramo de ribonucleótidos unidos covalentemente. Cuando interaccionan dos o más moléculas de ARN, por ejemplo, a través del apareamiento de bases, se forma un complejo de ARN. Por tanto, como se usa en este documento, un complejo de ARN comprende dos o más moléculas de ARN. Las moléculas de ARN de un complejo pueden ser idénticas o pueden ser diferentes entre sí.

Preferiblemente, son capaces de formar pares de bases entre sí de tal modo que se forme un dúplex sobre parte de

o la longitud completa de las moléculas de ARN.

Las moléculas de ARN pueden modificarse... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar una nanopartícula de quitosana/ARNip que comprende las etapas de:

a. Proporcionar una solución de quitosana

b. Proporcionar una solución de ARNip

c. Mezclar la solución de la etapa a con la solución de la etapa b

d. Incubar la solución de la etapa c en condiciones de formación de complejos de modo que se formen nanopartículas de quitosana/ARNip

- en el que la nanopartícula de quitosana/ARNip no comprende un reticulante inicial y

- en el que el peso molecular de la quitosana es mayor de 10 kDa y

- en el que la quitosana tiene un grado de desacetilación de al menos el 60%.

2. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la solución de ARNip comprende ARNip a una concentración de al menos 5 M.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución de quitosana comprende quitosana a una concentración de al menos 50 g/ml.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la nanopartícula se forma a una proporción N:P mayor de 50.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución de ARNip comprende ARNip a una concentración inferior a 100 M.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la nanopartícula se forma a una proporción N:P inferior a 70.

7. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 ó 6, en el que la concentración del ARNip es mayor de 100 M.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de quitosana es menor de 250 g/ml.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tamaño de la partícula está entre 10 y 500 nm.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las partículas formadas son de forma discretas y tienen un índice de polidispersidad inferior a 0,4.

11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la partícula es para administración sistémica o para administración a la mucosa.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la partícula es para administración en aerosol.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que las gotas del aerosol se caracterizan porque son más pequeñas de 30 m de diámetro.

14. Una nanopartícula preparada por el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

15. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 14 para su uso como medicamento.

16. Uso de una nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 14 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, infección vírica tal como la influenza, y la tuberculosis y afecciones inflamatorias tales como artritis, enfermedad de Crohn, y fiebre del heno.