ADMINISTRACION DE ARNSIS.
Una mezcla de administración que consiste esencialmente en:
un dendrímero seleccionado del grupo que consiste en un dendrímero de generación 2,
un dendrímero de generación 3 y un dendrímero de generación 5, en el que el dendrímero es PAMAM, diaminobutano (DAB) o polietilenglicol (PEG);
una cantidad efectiva de un ácido nucleico capaz de mediar la interferencia de ARN (ARNi) en la que el ácido nucleico es una molécula de ARN seleccionada del grupo que consiste en un ARN interferente pequeño (ARNsi) y ARN de horquilla corto (ARNsh):
y
un vehículo farmacéuticamente aceptable
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/037886.
Solicitante: UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: ONE BEACON STREET, 26TH FLOOR,BOSTON, MA 02108.
Inventor/es: RANA,TARIQ,M.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 21 de Abril de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/113D
- C12N15/11M
Clasificación PCT:
- C12N15/11 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
Clasificación antigua:
- A61K48/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
- C07H21/04 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
Fragmento de la descripción:
Administración de ARNsis.
Campo técnico
La presente invención se refiere a la administración de ARNsis.
Antecedentes
La interferencia de ARN (ARNi) es un procedimiento potente y específico para silenciar o reducir la expresión de un gen diana, mediado por pequeñas moléculas de ARN mono- o bicatenarias. Estas moléculas incluyen ARNs interferentes pequeños (ARNsis), microARNs (ARNmis), ARNs en horquilla pequeños (ARNshs), y otros. Aunque el mecanismo por el que funciona la ARNi no está completamente dilucidado, está claro que la ARNi es un procedimiento de tratamiento prometedor, por ejemplo, dirigiendo ARNms específicos para eliminación. Un obstáculo para el desarrollo de la tecnología de ARNi para usos terapéuticos ha sido que la mayoría de los procedimientos de administración de ARNs que median la ARNi son tóxicos para la células in vitro e in vivo.
Sumario
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de procedimientos de administración de ARNsi que utilizan péptidos de administración o agentes químicos con poca o ninguna toxicidad, por ejemplo, apropiados para el uso in vivo. La invención se define en las reivindicaciones.
Se describe un procedimiento para administrar un ARNsi o precursor de ARN manipulado genéticamente a una célula obteniendo una célula, conjugando al menos un péptido de administración a un ARNsi o precursor de ARN manipulado genéticamente para formar un conjugado de péptido y poner en contacto la célula con el conjugado de péptido. El péptido de administración puede ser un péptido Tat. El péptido de administración puede tener una secuencia sustancialmente similar a la secuencia de SEQ ID NO. 12. El péptido de administración puede ser un péptido homeobox (hox), un MTS, VP22 y/o MPG.
También se desvela un procedimiento para administrar un ARNsi a una célula obteniendo una célula, formando una mezcla que comprende un ARNsi y al menos un dendrímero y poniendo en contacto la célula con la mezcla. En una realización, el dendrímero es PAMAM.
También se desvela un kit para conjugar un péptido de administración con un ARNsi, que comprende el péptido de administración y un agente activador. En una alternativa, el kit contiene un péptido de administración Tat, homeobox (hox), MTS, MPG y/o VP22.
También se desvela un kit para preparar una mezcla de administración de ARNsi que comprende un dendrímero e instrucciones para el uso en el mezclado con un ARNsi, y el dendrímero puede ser PAMAM.
También se desvela una mezcla de administración de ARNsi que comprende un dendrímero.
Se desvela un ARNsi o precursor de ARN manipulado genéticamente conjugado con un péptido de administración y el péptido de administración puede ser Tat, homeobox (hox), VP22, MPG y/o MST.
También se desvelan biconjugados de péptidos de localización, por ejemplo, péptidos homeobox (hox), péptidos TAT, secuencia de translocación de membrana, PenetratinTM y/o transportina, que potencian la captación de ARNsi y de ese modo promueven el silenciamiento génico in vivo. Estos péptidos son apropiados para su uso en células vivas.
En otro aspecto, la invención presenta dendrímeros, por ejemplo, dendrímeros de poliamidoaminas (PAMAM), que aumentan la captación de ARNsi y son apropiados para promover el silenciamiento génico in vivo.
Un "gen diana" es un gen cuya expresión debe inhibirse o "silenciarse" selectivamente. Este silenciamiento se logra escindiendo el ARNm del gen diana mediante un ARNsi, por ejemplo, un ARNsi aislado o uno que se crea a partir de un ARN precursor manipulado genéticamente. Una porción o segmento de vástago bicatenario del ARN precursor del ARNsi, o una hebra del ARNsi, es una hebra antisentido que es complementaria, por ejemplo, totalmente complementaria, a una sección, por ejemplo, aproximadamente 16 a aproximadamente 40 o más nucleótidos, del ARNm del gen diana.
Una "molécula o secuencia de ácido nucleico aislado" es una molécula o secuencia de ácido nucleico que no está inmediatamente contigua a ambas secuencias codificadoras a las que está inmediatamente contigua (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del que se obtiene. El término, por ello, incluye, por ejemplo, un ARN o ADN recombinante que está incorporado en un vector; en un plásmido o virus de replicación autónoma; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o por tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional.
La expresión "manipulado genéticamente", como en un ARN precursor manipulado genéticamente, o una molécula de ácido nucleico manipulada genéticamente, indica que el precursor o molécula no se encuentra en la naturaleza, en el sentido que toda o parte de la secuencia de ácido nucleico del precursor o molécula es creada o seleccionada por el hombre. Una vez creada o seleccionada, la secuencia puede replicarse, traducirse, transcribirse o procesarse de otra manera por mecanismos dentro de una célula. De este modo, un ARN precursor producido dentro de una célula a partir de una molécula de ácido nucleico manipulada genéticamente, por ejemplo, un transgen, es un precursor de ARN manipulado genéticamente. Los precursores de ARN manipulados genéticamente son construcciones artificiales que son similares a los precursores naturales de ARNs temporales pequeños (ARNsts) que son procesados en el organismo para formar ARNsis. Los precursores de ARN manipulados genéticamente pueden sintetizarse mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como están comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.) o pueden ser codificados por moléculas de ácido nucleico.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria poseen el mismo significado comúnmente entendido por aquel con experiencia común en la técnica al que pertenece la presente invención. Aunque pueden utilizarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen más adelante procedimientos y materiales apropiados. En caso de conflicto, regirá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solamente ilustrativos y no tienen por objeto ser restrictivos.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La Fig. 1A es un gráfico de líneas de la intensidad de fluorescencia de Cy3 de ácidos nucleicos aislados de células transfectadas con ARNsi de CDK9 marcado con Cy3, mediante PAMAM o LipofectamineTM.
La Fig. 1B es un gráfico de barras de la intensidad de fluorescencia máxima a 570 nM para cada una de las condiciones que se muestran en la figura 1A.
La Fig. 2 es una fosforimagen de una inmunotransferencia de expresión de Ciclina T1 humana (hCycT1) y quinasa 9 dependiente de ciclina (CDK9) en células transfectadas con ARNsi de CDK9 marcado con Cy3, mediante PAMAM.
La Fig. 3A es un gráfico de líneas de la intensidad de fluorescencia de Cy3 de ácidos nucleicos aislados de células transfectadas con ARNsi de CDK9 marcado con Cy3 modificado con TAT o ARNsi de CDK9 marcado con Cy3 no modificado con control, transfectadas utilizando LipofectamineTM.
La Fig. 3B es un gráfico de barras de la intensidad de fluorescencia máxima a 570 nM para cada una de las condiciones que se muestran en la figura 3A.
La Fig. 4 es un gráfico de barras de la relación entre la intensidad de fluorescencia de la Proteína Fluorescente Verde potenciada diana (EGFP) y el fluoróforo control de Proteína Fluorescente Roja (RFP).
La Fig. 5 es una fosforimagen de una inmunotransferencia de la expresión de Ciclina T1 humana (hCycT1) y quinasa 9 dependiente de ciclina (CDK9) en células transfectadas con ARNsi de CDK9 marcado con Cy3 modificado con TAT o ARNsi de CDK9 marcado con Cy3 no modificado con control transfectadas utilizando LipofectamineTM.
Reivindicaciones:
1. Una mezcla de administración que consiste esencialmente en:
un dendrímero seleccionado del grupo que consiste en un dendrímero de generación 2, un dendrímero de generación 3 y un dendrímero de generación 5, en el que el dendrímero es PAMAM, diaminobutano (DAB) o polietilenglicol (PEG);
una cantidad efectiva de un ácido nucleico capaz de mediar la interferencia de ARN (ARNi) en la que el ácido nucleico es una molécula de ARN seleccionada del grupo que consiste en un ARN interferente pequeño (ARNsi) y ARN de horquilla corto (ARNsh):
y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
2. La mezcla de administración de la reivindicación 1, en la que el ARNsi comprende una hebra homosentido y una hebra antisentido, en la que la hebra antisentido posee una secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARNm diana para dirigir el ARNi específico de la diana.
3. La mezcla de administración de la reivindicación 2, en la que la hebra homosentido y la hebra antisentido están reticuladas.
4. La mezcla de administración de la reivindicación 3, en la que el ARNsi contiene una única reticulación.
5. La mezcla de administración de la reivindicación 3, en la que la hebra homosentido y la hebra antisentido están reticuladas con psoraleno.
6. La mezcla de administración de la reivindicación 1, en la que el ARNsi comprende una modificación en el OH del extremo 3' de la hebra homosentido o la hebra antisentido.
7. La mezcla de administración de la reivindicación 6, en la que la modificación en el OH del extremo 3' es una biotina, un péptido, una nanopartícula, un peptidomimético, un dendrímero, una biotina fotoescindible o un dendrímero.
8. La mezcla de administración de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en la que el ARNsi tiene una longitud de entre aproximadamente 16 y 30 nucleótidos, o el ARNsi tiene una longitud de aproximadamente 21 nucleótidos.
9. La mezcla de administración de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la que las hebras antisentido y homosentido se alinean de tal manera que el ARNsi posee proyecciones de entre 1 y 4 nucleótidos en 3'.
10. La mezcla de administración de la reivindicación 9, en la que el ARNsi posee proyecciones de 2 nucleótidos en 3'.
11. La mezcla de administración de la reivindicación 10, en la que las proyecciones de 2 nucleótidos en 3' son dTdT o UU.
12. La mezcla de administración de la reivindicación 1, en la que:
el PAMAM y el ácido nucleico capaz de mediar la interferencia de ARN están presentes en una relación PAMAM:ácido nucleico de entre aproximadamente 10 µg y aproximadamente 1 mg de PAMAM por 100 pmol de ácido nucleico;
el PAMAM y el ácido nucleico capaz de mediar la interferencia de ARN están presentes en una relación PAMAM:ácido nucleico de entre aproximadamente 20 µg y aproximadamente 40 µg de PAMAM por 100 pmol de ácido nucleico; o
el PAMAM y el ácido nucleico capaz de mediar la interferencia de ARN están presentes en una relación PAMAM:ácido nucleico de aproximadamente 40 µg de PAMAM por 100 pmol de ácido nucleico.
13. La mezcla de administración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en terapia.
14. Una composición farmacéutica que comprende la mezcla de administración de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Un procedimiento in vitro para administrar un ácido nucleico capaz de mediar la interferencia de ARN (ARNi) a una célula, comprendiendo el procedimiento:
Patentes similares o relacionadas:
MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA INTERFERENCIA DE RNA, del 11 de Noviembre de 2011, de COLD SPRING HARBOR LABORATORY: Un método para atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método introducir en la célula de mamífero in vitro, […]
NANOPARTÍCULAS PARA LA ADMINISTRACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO, del 4 de Julio de 2011, de AARHUS UNIVERSITET: Un procedimiento para preparar una nanopartícula de quitosana/ARNip que comprende las etapas de: a. Proporcionar una solución de quitosana b. Proporcionar […]
PROCEDIMIENTO Y COMPOSICIONES PARA REDUCIR LAS CANTIDADES DE GENOMA VIRAL DE VHC EN UNA CÉLULA DIANA, del 17 de Junio de 2011, de THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY: Un agente inhibidor de miR122, para uso en el tratamiento de un huésped que padece una afección patológica mediada por VHC, en el que dicho agente […]
CONSTRUCCIONES PARA LA EXPRESIÓN INDUCIBLE DE ARN DE INTERFERENCIA PEQUEÑO (ARNS) PARA EL SILENCIAMIENTO GÉNICO SELECCIONADO, del 14 de Abril de 2011, de MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V.: Un vector recombinante para la expresión regulable de una molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria en una célula eucariota, que comprende al menos una secuencia que […]
OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS BICATENARIOS PARA LA INHIBICIÓN DIRIGIDA A LA EXPRESIÓN GÉNICA, del 9 de Marzo de 2011, de SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH: Oligonucleótido de fórmula I **Fórmula** en donde N y N' son nucleótidos presentes o no en la naturaleza, de los cuales 21 nucleótidos son complementarios entre sí y en donde […]
MEDIADORES DE INTERFERENCIA POR ARN ESPECIFICOS DE SECUENCIAS DE ARN, del 19 de Abril de 2010, de WHITEHEAD INSTITUTE FOR BIOMEDICAL RESEARCH
MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FIRDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V.
MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY
UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS MEDICAL CENTER: Un procedimiento para producir ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud que comprende:
(a) combinar ARN bicatenario con un […]
ANALOGOS DE RNA PEQUEÑOS DE INTERFERENCIA (SIRNA), del 28 de Enero de 2010, de SANTARIS PHARMA A/S: Un compuesto bicatenario que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante, en el que cada hebra comprende 12-35 nucleótidos y en el […]
CARBOHIDRATO U OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS EN POSICIÓN 2' QUE TIENEN ENLACES INTERNUCLEOSIDICOS ALTERNOS, del 7 de Diciembre de 2011, de ISIS PHARMACEUTICALS, INC.: Un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos modificados en posición 2' unidos covalentemente que tienen la fórmula: en la que : cada […]