OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS BICATENARIOS PARA LA INHIBICIÓN DIRIGIDA A LA EXPRESIÓN GÉNICA.

Oligonucleótido de fórmula I **Fórmula** en donde N y N' son nucleótidos presentes o no en la naturaleza,

de los cuales 21 nucleótidos son complementarios entre sí y en donde la hebra del nucleótido (N')y, es la hebra no codificadora o bien la hebra complementaria al gen diana, x e y son iguales cada uno a 21, n es independientemente igual a 4 hasta 6, m es independientemente igual a 0 hasta 20, p es independientemente igual a 0 hasta 10, W y Z son nucleótidos presentes o no en la naturaleza, que están enlazados a través de un enlace 3'5' o 2'5' entre nucleósidos, Li es un enlazador que une las dos hebras de nucleótidos de forma covalente, caracterizado porque al menos cuatro residuos Z y eventualmente dos residuos W están enlazados a través de un enlace 2'5' entre nucleósidos y son monocatenarios

La presente invención se refiere a nuevos derivados de oligonucleótido que son al menos en parte bicatenarios y que tienen un residuo de oligonucleótido enlazado en 2'5' en al menos un extremo 3', y al uso de los mismos para la inhibición dirigida de la expresión génica. 5

La inhibición de la expresión génica con ayuda de ácidos nucleicos sintéticos está ganando cada vez más importancia. Representantes típicos de estos ácidos nu-cleicos sintéticos (oligonucleótidos) son oligonucleótidos no codificantes, ribozimas, enzimas del ADN y secuencias guía externas (EGS - siglas en inglés). Los "oligonu-cleótidos no codificantes" son derivados de ácido nucleico monocatenarios cortos que 10 se unen a un ácido ribonucleico mensajero (ARNm) complementario a través de un apareamiento de bases de Watson-Crick, cuya traducción en la proteína correspon-diente debe ser inhibida. En la mayoría de los casos, los oligonucleótidos no codifican-tes despliegan su acción según un mecanismo que es sustentado por la ribonucleasa H celular (ARNasa H), que se confirma por numerosos estudios. La ARNasa H, que 15 aparece en todas las células, reconoce una cadena doble a base de ADN y ARN y cor-ta el ARNm complementario al oligonucleótido mediante hidrólisis de uno o varios en-laces fosfodiéster. Se conoce cómo deben estar modificados los oligonucleótidos con el fin de que pueda tener lugar una activación de la ARNasa H. Esto se describe, por ejemplo, en "Uhlmann (2000) Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 3, 203-213". Las ribozimas 20 sintéticas llevan esta actividad nucleasa en su secuencia. El tipo de ribozima más co-nocido son las denominadas ribozimas de "cabeza de martillo", en las cuales la se-cuencia de consenso GAAAC, derivada de ribozimas que se presentan de forma natu-ral, forma la parte de la ARNasa, y las secuencias flanqueantes forman la parte del oligonucleótido no codificante. De manera similar actúan las enzimas del ADN, las 25 cuales, no obstante, no se derivan de motivos de ribozimas que se presentan de forma natural, sino que se encontraron por una selección in vitro. Las EGS son análogos de ARN sintéticos, que activan la ARNasa P celular y se unen al ARNm diana a través de secuencias flanqueantes correspondientes e inician una degradación específica del ARNm. Todos los derivados de oligonucleótidos mencionados anteriormente, se em-30 plean de modo que la parte que se une al ARN es monocatenaria y la interacción con el ARNm diana inhibe la expresión génica de forma específica de la secuencia.

También es posible inhibir la expresión génica mediante la interacción con pro-teínas particulares, con la ayuda de oligómeros denominados “señuelo” que imitan las regiones de unión para los factores de transcripción. El tratamiento con agentes se-35

ñuelo hace posible la intercepción de proteínas particulares, particularmente de facto-res de transcripción, en una manera específica de la secuencia y de este modo, se evita una activación de la transcripción.

Finalmente, hay derivados de oligonucleótidos que actúan a nivel del ADN. Es-tos incluyen los oligonucleótidos que forman tríplex (oligonucleótidos anti-gen). Los 5 “oligonucleótidos anti-gen” se unen a través del apareamiento de bases de tipo Hoogs-teen, en el surco grande de la doble hélice del ADN, con la formación de una hélice triple, causando de este modo la inhibición específica de la secuencia, de la transcrip-ción de los genes. Otro grupo de derivados de oligonucleótidos que actúan de forma intracelular, los quimeraplastos, se utiliza para la corrección específica de genes. 10

Un problema común de la inhibición de la expresión génica con ayuda de oli-gonucleótidos sintéticos, es que siempre hay que someter a ensayo un número relati-vamente elevado de oligonucleótidos contra diferentes regiones del ácido nucleico diana, para identificar una secuencia eficaz. Además, los oligonucleótidos no codifican-tes inhiben frecuentemente de forma ineficaz o incompleta la expresión génica. 15 Además, se observaron efectos secundarios no específicos de la secuencia, los cuales se pueden basar en que secuencias parciales relativamente cortas, de aproximada-mente cinco bases de longitud, ya activan la ARNasa H. Esto se muestra, por ejemplo, en "Woolf y col. (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7305-7309)". Sin embargo, también existen efectos secundarios que se basan en la interacción de los oligonucleó-20 tidos no codificantes con proteínas.

Recientemente, se ha descrito el uso de ARN bicatenario para inhibir la expre-sión génica. El ARN bicatenario (ARNds) es para células y organismos particulares una señal para inducir una degradación específica de la secuencia del ARNm, según un proceso que se conoce como ARN interferente (ARNi). El fenómeno del ARNi se 25 observó en una serie de diferentes organismos, tales como, por ejemplo, C. elegans, moscas, hongos, plantas y embriones de ratón. Se piensa que el ARNi es muy similar al silenciamiento del gen post-transcripcional (PTGS - siglas en inglés) observado en plantas o bien es idéntico a éste. Mediante la simple inyección de ARNds con una longitud de más de 500 pares de bases (pb), cuya secuencia de la cadena codificante es 30 idéntica a la del ARNm diana que se va a inhibir, se puede inhibir específicamente la expresión de un gen diana con la correspondiente secuencia de ADN. En este caso no se perjudica la expresión génica de genes no homólogos. La secuencia de bases del gen diana no se modifica en este caso. El ARNi es un proceso post-transcripcional en el cual el ARNds se escinde en primer lugar en fragmentos más pequeños que, a con-35

tinuación, se emplean probablemente para la degradación específica de la secuencia del ARNm diana. Aparte de la actividad nucleasa de la doble hebra, también se des-cribe una actividad helicasa que depende del ATP. Sin embargo, el mecanismo deta-llado de este proceso no se conoce. Estudios en plantas muestran que fragmentos pe-queños de ARNds con una longitud de aproximadamente 25 nucleótidos, representan 5 la “especie activa” del ARNi, el cual transfiere el reconocimiento específico de la se-cuencia del ARN diana, a una ribonucleasa celular.

La eficacia de la inhibición de la expresión génica con ayuda del ARNds dismi-nuye drásticamente cuando la longitud del fragmento del ARNds va disminuyendo. De este modo se observó que el ARNds de 400 a 540 pares de bases, inhibe la expresión 10 génica muy eficazmente, mientras que el ARNds de 200 a 300 pares de bases inhibe de forma menos eficaz y el ARNds de 50 a 100 pares de bases ya no tiene ningún efecto. Recientemente se ha observado que los fragmentos pequeños de ARNds de 26 a 81 pares de bases de longitud, también son capaces de provocar un proceso si-milar al del ARNi. Sin embargo, la inhibición observada parece ser substancialmente 15 más débil que en el caso de fragmentos largos de ARNds. La inhibición producida por un ARNds de 717 pb era mucho más pronunciada que la de un ARNds con una longi-tud inferior a 200 pb. El ARNds de 26 pb era aproximadamente 250 veces menos acti-vo que el ARNds de 81 pb. Por otra parte, la inhibición era dependiente de la secuen-cia, puesto que un ARNds de 27 pb diferente, no era activo en absoluto. 20

En Elbashir y col. Nature (2001) 411, 494, se describe una inhibición de la ex-presión génica en un cultivo celular a través de un ARN bicatenario que comprende 21 nucleótidos. Las moléculas de ARNds correspondientes contenían en los extremos 3' de ambas las hebras, partes sobresalientes de 2 nucleótidos unidas con un enlace 3'5', mostrando los nucleótidos sobresalientes bases de uracilo o de timina. En esta 25 memoria también se observa que los procesos de la ribonucleasa activada con 2'5' oligoadenilato, conducen a una degradación intrínseca que no es específica de la se-cuencia del ARN diana. Sin embargo, una desventaja obvia es el hecho de que el éxito de la inhibición depende fuertemente de la línea celular utilizada.

El documento de patente WO-A-94/01550 describe oligonucleótidos autoestabi-30 lizantes que forman una estructura denominada de “horquilla”, debido a que son com-plementarios (en parte). Ambas hebras del oligonucleótido están unidas a través de un enlazador.

Hasta ahora, una inhibición eficaz de la expresión génica se alcanzó principal-mente con ARNds de más de 100 pb de longitud. A este ARNds relativamente largo 35

sólo se puede acceder a través de una transcripción in vitro o in vivo a partir del ADN correspondiente...

1. Oligonucleótido de fórmula I

en donde

N y N' son nucleótidos presentes o no en la naturaleza, de los cuales 21 nucleótidos 5 son complementarios entre sí y en donde la hebra del nucleótido (N')y, es la hebra no codificadora o bien la hebra complementaria al gen diana,

x e y son iguales cada uno a 21,

n es independientemente igual a 4 hasta 6,

m es independientemente igual a 0 hasta 20, 10

p es independientemente igual a 0 hasta 10,

W y Z son nucleótidos presentes o no en la naturaleza, que están enlazados a través de un enlace 3'5' o 2'5' entre nucleósidos,

Li es un enlazador que une las dos hebras de nucleótidos de forma covalente,

caracterizado porque al menos cuatro residuos Z y eventualmente dos residuos W 15 están enlazados a través de un enlace 2'5' entre nucleósidos y son monocatenarios.

2. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en don-de m es 0 a 10.

3. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 2, en don-de m es 0 a 6. 20

4. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 3, en donde m es igual a 0.

5. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, en donde p es 0 a 5.

6. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 5, en 25 donde p es igual a cero.

7. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, con la condición de que su ARN diana homólogo presente uno de los siguientes modelos de secuencia.

5'-(U)v-(M)z-(U)w 30

5'-(U)v-(M)z-UX

5'-UX-(M)z-UX y

5'-(U)v-(M)z.

en donde v, independientemente, es igual a 2 hasta 20,

en donde w, independientemente, es igual a 2 hasta 20,

z, independientemente, es 15 a 25,

U es una uridina y M es igual a A, G, C o U y X es igual a A, G o C. 5

8. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 7, en donde v es 2 a 10.

9. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde v es 2 a 6.

10. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con una o varias de las reivin-10 dicaciones 7 a 9, en donde w es 2 a 10.

11. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 10, en donde w es 2 a 6.

12. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 7 a 11, en donde z es 16 a 23. 15

13. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 12, en donde z es 19 a 21.

14. Oligonucleótido de fórmula I según una o varias de las reivindicaciones 1 a 13, en donde Z representa adenosina ó 3'-desoxiadenosina.

15. Oligonucleótido de fórmula I según una o varias de las reivindicaciones 20 1 a 14, en donde uno o varios puentes fosfodiéster naturales están reemplazados por puentes entre nucleótidos no naturales, que estabilizan la degradación de la nucleasa.

16. Oligonucleótido de fórmula I según una o varias de las reivindicaciones 1 a 15, en donde uno o varios enlaces fosfodiéster naturales están reemplazados por enlaces fosforotioato. 25

17. Oligonucleótido de fórmula I según una o varias de las reivindicaciones 1 a 16, en donde uno o varios enlaces fosfodiéster naturales están reemplazados por enlaces fosforotioato, en donde estas modificaciones se encuentran en los extremos y en los nucleótidos de pirimidina internos.

18. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con una o varias de las reivin-30 dicaciones 1 a 5 o 7 a 17, en donde Li es un nucleótido presente o no en la naturaleza.

19. Oligonucleótido de fórmula I de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5 o 7 a 17, en donde Li es un enlazador no nucleotídico.

20. Procedimiento para la inhibición de la expresión génica de un gen diana en una célula in vitro con ayuda de uno o más oligonucleótidos según una o varias de 35

las reivindicaciones 1 a 19, en donde primero se prepara un oligonucleótido comple-mentario a un gen diana correspondiente, este oligonucleótido se introduce en una célula, la célula se incuba y, a continuación, se determina la inhibición de la expresión génica del gen diana mediante mediciones comparativas de la cantidad de ARNm co-rrespondiente o del correspondiente producto génico en una célula testigo. 5

21. Procedimiento según la reivindicación 20, para inhibir la expresión géni-ca de un gen diana en una célula en la que la sintasa de 2'5'-oligoadenilato está hipo-expresada o es defectuosa en comparación con una célula testigo.

22. Medicamento que contiene un oligonucleótido según una o varias de las reivindicaciones 1 a 19, así como sustancias aditivas y/o de soporte y, eventualmente, 10 coadyuvantes para la preparación o la formulación de un medicamento.

23. Uso de un oligonucleótido según una o varias de las reivindicaciones 1 a 19, para la identificación o la validación de nuevos genes diana terapéuticos.

24. Uso de un oligonucleótido según una o varias de las reivindicaciones 1 a 19, para la identificación o la validación de nuevos genes diana en la investigación 15 fitoprotectora.

25. Procedimiento para la preparación de un oligonucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 19, en donde los oligonucleótidos se pre-paran en primer lugar en solución o sobre una fase fija por acoplamiento sucesivo o por bloques, eventualmente se hibridan en forma bicatenaria y después de la prepara-20 ción se aíslan y se purifican.

26. Procedimiento para la preparación de un medicamento, en donde se prepara un derivado oligonucleotídico de acuerdo con la reivindicación 25, y eventual-mente se mezcla con otros aditivos y/o soportes y eventualmente coadyuvantes.