Un procedimiento para producir ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud que comprende:

(a) combinar ARN bicatenario con un extracto soluble que media en la interferencia por ARN, produciendo de este modo una combinación; y

(b) mantener la combinación de (a) en condiciones en las que el ARN bicatenario se procesa para dar ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud

Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN.

Antecedentes de la invención

La interferencia por ARN o "iARN" es un término inicialmente acuñado por Fire y colaboradores para describir la observación de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811). El ARNbc dirige el silenciamiento postranscripcional, específico de genes en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para el estudio de la función génica. La iARN implica la degradación del ARNm, pero se desconocen muchos de los mecanismos bioquímicos subyacentes a esta interferencia. Se necesita la recapitulación de las características principales de la iARN in vitro para el análisis bioquímico del fenómeno.

Tuschl T et al (Genes Dev., 13, 3191-97, 1999) dan a conocer un extracto libre de células del blastodermo sincitial de embriones de Drosophila que media en la interferencia por ARN. Se describe el uso del extracto para estudiar la iARN. La referencia concluye que se requiere una longitud mínima de ARNbc de más de 49 pares de bases.

Hammond SM et al (Nature, 404, 293-96, 2000) dan a conocer el silenciamiento de la expresión génica en células de Drosophila cultivadas mediante transfección con ARN bicatenario específico de secuencia. Se encuentra que los extractos de las células transfectadas contienen una actividad nucleasa que cofracciona con fragmentos de ADN de aproximadamente 25 pb.

Sumario de la invención

La presente invención, que se define mediante las reivindicaciones adjuntas, proporciona un procedimiento para producir ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud que comprende:

También se describen procedimientos relacionados que usan la interferencia por ARN, incluyendo procedimientos para mediar en la interferencia por ARN, de examen de la función génica, de la producción de células silenciadas y de la identificación de los ARN de 21-23 nucleótidos que median en la interferencia por ARN.

Los procedimientos de la presente invención se identificaron usando la interferencia mediada por ARNbc específico de genes en un sistema libre de células derivado del blastodermo sincitial de embriones de Drosophila. El sistema in vitro complementa enfoques genéticos para analizar minuciosamente la base molecular de la iARN. Como se describe en el presente documento, se examinaron los mecanismos moleculares subyacentes a la iARN usando el sistema in vitro de Drosophila. Los resultados mostraron que la iARN es dependiente de ATP aunque se desacople de la traducción del ARNm. Es decir, no se requiere la síntesis de proteínas para la iARN in vitro. En la reacción de iARN, ambas cadenas (sentido y antisentido) del ARNbc se procesan dando lugar a fragmentos o segmentos pequeños de ARN desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos (nt) de longitud (los ARN con movilidad en geles de secuenciación que corresponden a marcadores que son de 21-23 nt de longitud, denominado opcionalmente en lo sucesivo ARN de 21-23 nt). El procesamiento del ARNbc en fragmentos pequeños de ARN no requiere el ARNm seleccionado como diana, lo que demuestra que las especies pequeñas de ARN se generan mediante el procesamiento del ARNbc y no como un producto de degradación de ARNm dirigido por ARNbc. El ARN sólo se rompe dentro de la región de identidad con el ARNbc. La ruptura se produce en sitios separados en 21-23 nucleótidos, el mismo intervalo observado para el propio ARNbc, lo que sugiere que los fragmentos de 21-23 nucleótidos del ARNbc guían la ruptura del ARNm. Esos ARN purificados de 21-23 nt que median en la iARN confirman que estos fragmentos guían la ruptura del ARNm.

Por consiguiente, lo que se describe en el presente documento son moléculas de ARN aisladas (bicatenario; monocatenario) desde 21 hasta 23 nucleótidos que median en la iARN. Es decir, los ARN aislados mediante la degradación de ARNm de un gen al que corresponde el ARN (median en la degradación del ARNm que es el producto transcripcional del gen, que también se denomina en lo sucesivo gen diana). Por conveniencia, tal ARNm también se denomina en lo sucesivo en el presente documento ARNm que va a degradarse. Como se usa en el presente documento, los términos ARN, molécula(s) de ARN, segmento(s) de ARN y fragmento(s) de ARN se usan indistintamente para referirse al ARN que media en la interferencia por ARN. Estos términos incluyen ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado (ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de manera recombinante), así como ARN alterado, que difiere del ARN que se produce de manera natural mediante la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al/a los extremo(s) del ARN de 21-23 nt o internamente (a uno o más nucleótidos del ARN). Los nucleótidos en las moléculas de ARN pueden comprender también nucleótidos no convencionales, incluyendo nucleótidos que no se producen de manera natural o desoxirribonucleótidos. Colectivamente, todos los ARN alterados se denominan en lo sucesivo análogos o análogos de ARN que se producen de manera natural. El ARN de 21-23 nucleótidos sólo necesita ser suficientemente similar al ARN natural que tiene la capacidad para mediar (media) en la iARN. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "media en la iARN" se refiere a (indica) la capacidad para distinguir que ARN van a degradarse mediante el maquinaria o proceso de la iARN. El ARN que media en la iARN interactúa con la maquinaria de la iARN de tal manera que dirige la maquinaria para degradar un ARNm particular. En una realización, se describen en el presente documento moléculas de ARN de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos que dirigen la ruptura del ARNm específico al que corresponde su secuencia. No es necesario que la correspondencia de las secuencias sea perfecta, sino que la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARN dirija la ruptura por iARN del ARNm diana. En una realización particular, las moléculas de ARN de 21-23 nt comprenden un grupo hidroxilo en 3'.

La presente invención también se refiere a procedimientos para producir moléculas de ARN de 21 a 23 nucleótidos con capacidad para mediar la ruptura por iARN. En una realización, se usa el sistema in vitro de Drosophila. En esta realización, se combina el ARNbc con un extracto soluble derivado de embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARNbc se procesa para dar moléculas de ARN de 21 a 23 nucleótidos. En otra realización, se usa el sistema in vitro de Drosophila para obtener secuencias de ARN de 21-23 nucleótidos que median en la interferencia por ARN del ARNm de un gen particular (por ejemplo, oncogén, gen viral). En esta realización, el ARN bicatenario que corresponde a una secuencia del gen que va seleccionarse como diana se combina con un extracto soluble derivado del embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARN bicatenario se procesa para dar lugar a ARN de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. Como se muestra en el presente documento, el ARN de 21-23 nt media en el ARN del ARNm del gen seleccionado como diana (el gen cuyo ARNm va a degradarse). El procedimiento para obtener los ARN de 21-23 nt utilizando el sistema in vitro de Drosophila además puede comprender aislar la secuencia de ARN de la combinación.

También se describe en el presente documento, el ADN de 21-23 nt producido mediante los procedimientos de la presente invención, así como los ARN de 21-23 nt, producidos mediante otros procedimientos, tales como síntesis química o técnicas de ADN recombinante, que tienen las mismas o substancialmente las mismas secuencias que los ARN producidos de manera natural que median en la iARN, tales como los producidos mediante los procedimientos de la presente invención. Todos estos se denominan en lo sucesivo ARN de...

1. Un procedimiento para producir ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud que comprende:

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además aislar el ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud a partir de la combinación.

3. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el ARN bicatenario corresponde a una secuencia de un gen que va a degradarse; y el ARN desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud media en la interferencia por ARN de ARNm del gen que va a degradarse, produciendo de este modo ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud que media en la interferencia por ARN del ARNm del gen.

4. Un procedimiento para mediar en la interferencia por ARN de ARNm de un gen en una célula o un organismo no humano que comprende:

5. Un procedimiento para examinar la función de un gen en una célula de prueba o un organismo de prueba, que comprende mediar en la interferencia por ARN de ARNm de un gen en una célula o un organismo según se reivindica en la reivindicación 4, en el que el organismo es un organismo no humano y la célula y el organismo son una célula de prueba y un organismo de prueba, respectivamente; y

6. Un procedimiento según la reivindicación 4, que comprende además:

7. Un procedimiento para evaluar si un agente actúa sobre un producto génico que comprende mediar en la interferencia por ARN de ARNm de un gen en una célula o un organismo según se reivindica en la reivindicación 4, en el que el organismo es un organismo no humano y:

8. Un procedimiento para evaluar si un producto génico es una diana adecuada para el descubrimiento de fármacos que comprende mediar en la interferencia por ARN de ARNm de un gen en una célula o un organismo según se reivindica en la reivindicación 4, en el que el organismo es un organismo no humano y la degradación del ARNm da como resultado una expresión disminuida del gen; y;

9. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en el que el gen codifica un ARNm celular o un ARNm viral.

10. Un procedimiento para producir células con silenciamiento génico, que comprende introducir en células en las que va a silenciarse un gen, ARN bicatenario aislado de desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud y que corresponde a una secuencia del gen, que se dirige al ARNm que corresponde al gen y que mantiene las células resultantes en condiciones en las que se produce la iARN, que da como resultado la degradación del ARNm del gen, produciendo de este modo células con silenciamiento génico.

11. Un procedimiento para identificar sitios diana dentro de ARNm que se rompe eficazmente mediante el proceso de iARN, que comprende combinar ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud y que corresponde a una secuencia de un gen que va a degradarse, ARNm marcado que corresponde al gen y un extracto soluble que media en la interferencia por ARN, produciendo de este modo una combinación; mantener la combinación en las condiciones en que el ARN bicatenario se degrada e identificar sitios en el ARNm que se rompen eficazmente.

12. Un procedimiento para identificar ARN de 21-23 nucleótidos que median eficazmente en la iARN, en el que dichos ARN de 21-23 nt abarcan los sitios diana identificados dentro del ARNm mediante la realización del procedimiento según la reivindicación 11, y que comprende además identificar un ARN de 21-23 nucleótidos que abarca los sitios diana.

13. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el ARN bicatenario se obtiene a partir de ARN bicatenario que se ha roto en fragmentos desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud.

14. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el ARN bicatenario comprende un grupo hidroxilo terminal en 3'.

15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el ARN bicatenario es ARN sintetizado químicamente.

16. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que el ARN comprende uno o más nucleótidos no convencionales, incluyendo nucleótidos no producidos en la naturaleza.

17. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que el ARN bicatenario se aísla utilizando un procedimiento seleccionado de electroforesis en gel, procedimientos no desnaturalizantes, o cromatografía en columna no desnaturalizante.

18. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que el ARN bicatenario es complementario a uno o más de ARNm celular de mamíferos, ARNm humano o ARNm viral.

19. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 6, 11 ó 12, en el que el extracto soluble se deriva de blastodermo sincitial de embriones de Drosophila.