Un compuesto GLP-1 di-PEGilado que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula:

en la que Xaa8 es: D-Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp o Lys; 10 Xaa33 es: Val o Ile; Xaa46 es: Cys o Cys-NH2; y en el que una molécula de PEG está unida covalentemente a Cys45 y una molécula de PEG está unida covalentemente a Cys46 o Cys46-NH

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos del péptido-1 del tipo de glucagón (GLP1) modificados con polietilenglicol (PEG) y compuestos relacionados que son útiles en el tratamiento de afecciones o trastornos que se benefician rebajando la glucosa en sangre, disminuyendo la ingestión de alimentos, disminuyendo el vaciado gástrico o intestinal, aumentando el número y/o la función de células beta (β) y/o la función y/o inhibiendo la apoptosis de las células β, o rebajando la motilidad gástrica o intestinal.

ANTECDENTES DE LA INVENCIÓN

El GLP-1 induce numerosos efectos biológicos tales como la estimulación de la secreción de insulina, la inhibición de la secreción de glucagón, la inhibición del vaciado gástrico, la inhibición de la motilidad gástrica o la motilidad intestinal, la intensificación de la utilización de glucosa y la inducción de pérdida de peso. Además, el GLP-1 puede actuar para prevenir el deterioro de las células β pancreáticas que se produce a medida que progresa la diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM). Una característica significativa de GLP1 es su capacidad de estimular la secreción de insulina sin el riesgo asociado de hipoglucemia. GLP-1 induce la secreción de insulina sólo cuando los niveles de glucosa se elevan, a diferencia de otras terapias que actúan aumentando la expresión de insulina sin considerar si los niveles de glucosa son elevados.

La utilidad de la terapia implicando péptidos GLP-1 ha sido limitada debido a que GLP1(1-37) es poco activo y los dos péptidos truncados naturales, GLP-1 (7-37)OH y GLP-1(736)NH2, se aclaran rápidamente in vivo y tienen semividas extremadamente cortas in vivo. Se sabe que la dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV) producida endógenamente inactiva péptidos GLP1 circulantes eliminando los restos de histidina N-terminal y alanina y es causa principal de la corta semivida in vivo.

Si bien varios enfoques han dado por resultado compuestos GLP-1 con una más larga semivida o mayor potencia que la de GLP-1 nativo, se necesitan más compuestos para disminuir más el aclaramiento y aumentar la semivida, optimizando así la capacidad de GLP-1 de ser útil como agente terapéutico que se puede administrar un número mínimo de veces durante un prolongado período de tiempo. Las solicitudes de patente internacional nos . PCT/US2004/006082 y PCT/CTS2000/11814 describen una unión covalente de una o varias moléculas de PEG a varios PLG-1 y compuestos de exendina. Estos compuestos pueden tener una semivida de más de 24 horas, lo que permite menos administraciones del compuesto GLP1 PEGilado mientras que se mantiene un nivel alto en sangre del compuesto durante un prolongado período de tiempo.

Más investigación ha dilucidado un problema que es que durante un almacenamiento prolongado en envase se produce la separación de PEG de un GLP-1 PEGilado o exendina. Como resultado, el péptido GLP-1 o exendina aumenta el perfil de exposición de la concentración pico inicial a través de la ventana terapéutica. Esto tiene la posibilidad de aumentar los efectos secundarios de náusea y vómitos.

La presente invención busca eludir los problemas asociados con un almacenamiento prolongado en envase y la potencial separación de PEG de GLP-1 PEGilado o compuesto de exendina introduciendo dos sitios de PEGilación en un compuesto GLP-1 o exendina y PEGilando luego esos dos sitios de PEGilación simultáneamente. Las ventajas de este enfoque son como mínimo cuádruples. Primeramente, la PEGilación de los compuestos mejorará espectacularmente las semividas in vivo de los compuestos. Segundo, la PEGilación de los compuestos ralentizará la velocidad de absorción del compuesto y reducirá por ello la disgregación inicial del fármaco que se cree es responsable de los efectos secundarios. Tercero, se pueden usar PEG lineales directamente para la PEGilación y ello simplificará el procedimiento de síntesis. Cuarto una PEGilación emparejada aliviará los acontecimientos asociados con un almacenamiento en envase prolongado y la posibilidad de separación de PEG del compuesto PGL-1 PEGilado o de exendina por disminuir la probabilidad de que ambos PEG se separen de la misma molécula de péptido GLP-1 o exendina.

Además, la introducción de dos sitios de PEGilación en el compuesto GLP-1 o de exendina en el extremo C-terminal del compuesto y luego la PEGilación de esos dos sitios de PEGilación simultáneamente da compuestos PEGilados que tienen mayor actividad que los compuestos PEGilados en los que al menos uno de los sitios de PEGilación no está en el extremo C-terminal del péptido. Además, la unión de un conector que comprende dos sitios de PEGilación en el extremo C-terminal de un compuesto GLP-1 y la posterior PEGilación simultánea de esos dos sitios de PEGilación da por resultado compuestos GLP-1 PEGilados que tienen una actividad mayor que la de los compuestos PEGilados en los que los sitios de PEGilación están unidos al extremo C-terminal de un compuesto GLP-1 sin conector.

Tales compuestos GLP-1-PEGilados se pueden usar terapéuticamente para tratar sujetos con trastornos, incluidos diabetes, obesidad, anormalidades en la motilidad gástrica y/o intestinal, deficiencia de células (por ejemplo, células β insuficientes o que no funcionan) y anormalidades en el vaciado gástrico y/o intestinal, siendo una ventaja el que los compuestos GLP-1 PEGilados de la invención requieren dosis menores durante un período de 24 horas, aumentando así la conveniencia para un sujeto que necesita tal terapia y la probabilidad de que el sujeto acepte los requerimientos de la dosificación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

5 La invención descrita en esta memoria proporciona compuestos GLP-1 unidos covalentemente a dos moléculas de polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo en el que cada PEG está unido a un resto de cisteína, dando ello por resultado compuestos GLP-1 PEGilados con una semivida de eliminación de como mínimo una hora o, de como mínimo 3, 5, 7, 10, 15, 20 horas, o de como mínimo 24 horas. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la

10 presente invención tienen un valor de aclaramiento de 200 ml/h/kg o menos, o 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg o menos, o menos de 50, 40 o 20 ml/h/kg. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos de la fórmula

**(Ver fórmula)**

en la que Xaa8 es: D-Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp o Lys; Xaa33 es: Val o Ile; Xaa46 es: Cys o Cys-NH2; y en los que una molécula de PEG está unida covalentemente a Cys45 y una molécula de PEG está unida covalentemente a Cys46 o Cys46-NH2.

Preferiblemente, para los compuestos GLP-1 PEGilados de Fórmula I: Xaa8 es Gly o Val; Xaa22 es Gly o Glu; Xaa33 es Val o ile, y Xaa46 es Cys o Cys-NH2. Son también preferibles 25 los compuestos GLP-1 PEGilados de Fórmula I en los que Xaa8 es Val; Xaa22 es Glu; Xaa33 es Val o Ile, y Xaa46 es Cys o Cys-NH2. También son preferibles los compuestos GLP-1 PEGilados de Fórmula I en los que Xaa8 es Val; Xaa22 es Glu; Xaa33 es Val y Xaa46 es Cys. También son preferibles los compuestos GLP-1 PEGilados de Fórmula I en los que Xaa8 es Val, Xaa22 es Glu; Xaa33 es Val y Xaa46 es Cys-NH2. También son preferibles los compuestos PGL-1 PEGilados de Fórmula I en los que Xaa8 es Val; Xaa22 es Glu; Xaa33 es Ile y Xaa46 es Cys. También son preferibles los compuestos PGL-1 PEGilados de Fórmula I en los que Xaa8 es Val; Xaa22 es Glu; Xaa33 es Ile y Xaa46 es Cys-NH2.

Los polímeros polietilenglicol (“PEG”) usados en la invención tienen pesos moleculares entre 500 y 100.000 daltons, o entre 5.000 y 40.000 daltons, o entre 20.000 y 60.000 daltons, o entre 20.000 y 40.000 daltons, y pueden ser moléculas lineales o ramificadas, y pueden ser derivados de polietilenglicol como los descritos en la técnica. La molécula de PEG unida covalentemente a compuestos GLP-1 en la presente invención no está limitada a un tipo particular. Preferiblemente, el PEG es una metoxi PEG maleimida lineal de 20 kilodalton. Más preferiblemente, el PEG es

**(Ver fórmula)**

10 La presente invención abarca compuestos para estimular el receptor de GLP-1 en un sujeto que necesita tal estimulación, Los compuestos se administran al sujeto en una cantidad eficaz de un compuesto GLP-1 PEGilado descrito aquí. Entre los sujetos que necesitan la estimulación del receptor de GLP-1 figuran los de diabetes no dependiente de insulina, hiperglucemia inducida por tensión, obesidad,...

1. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula:

**(Ver fórmula)**

en la que Xaa8 es: D-Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp o Lys; Xaa33 es: Val o Ile; Xaa46 es: Cys o Cys-NH2; y en el que una molécula de PEG está unida covalentemente a Cys45 y una molécula de PEG está unida covalentemente a Cys46 o Cys46-NH2.

2. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que Xaa8 es Gly o Val, y Xaa22 es Gly o Glu.

3. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que Xaa8 es Val y Xaa22 es Glu.

4. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Xaa8 es Val, Xaa22 es Glu, Xaa33 es Ile y Xaa46 es Cys-NH2.

5. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con una cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 4, en el que las moléculas de PEG tienen pesos moleculares entre 5.000 y

40.000 daltons.

6. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 4, en el que las moléculas de PEG tienen pesos moleculares entre 20.000 30 y 60.000 daltons.

7. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las moléculas de PEG tienen pesos moleculares entre 20.000 y 40.000 daltons.

8. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cada una de las moléculas de PEG usadas en una reacción de PEGilación es una metoxiPEGmaleimida lineal de 20.000 dalton.

9. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con una cualquiera de las 10 reivindicaciones precedentes, en el que las moléculas de PEG se unen simultáneamente.

10. Un compuesto GLP-1 di-PEGilado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que un conector que comprende los sitios de PEGilación Cys45 y Cys46 o Cys46-NH2 está unido al extremo C del compuesto GLP-1.

11. El compuesto GLP-1 di-PEGilado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso como medicamento.

12. El compuesto GLP-1 di-PEGilado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para 20 uso en el tratamiento de la diabetes no dependiente de insulina o la obesidad.

13. Uso de un compuesto GLP-1 di-PEGilado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes no dependiente de insulina o la obesidad.