Un procedimiento para diagnosticar un neoplasma que tiene una expresión en exceso de ADAM8 en un mamífero,

comprendiendo dicho procedimiento detectar la expresión en exceso de un gen que codifica un polipéptido ADAM8 en una célula de ensayo obtenida del mamífero

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de tumores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5

Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, después de las cardiopatías (Boring y col., CA Cancel J. Clin. 43: 7 [1993]).

El cáncer se caracteriza por un aumento en el número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que se diseminan eventualmente mediante la sangre o el 10 sistema linfático hasta los nódulos linfáticos regionales y hasta sitios distantes (metástasis). En un estado canceroso, una célula prolifera en condiciones en las que las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta por sí mismo en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y de agresividad.

La alteración de la expresión génica está íntimamente relacionada con el crecimiento celular descontrolado y la desdiferenciación, que son características comunes de todos los cánceres. Se ha encontrado que los 15 genomas de algunos tumores bien estudiados muestran una disminución en la expresión de los genes recesivos, denominados generalmente como genes de supresión tumoral, que funcionarían normalmente para evitar el crecimiento de células malignas, y/o la expresión en exceso de algunos genes dominantes, tales como los oncogenes, que actúan para promover el crecimiento maligno. Cada uno de estos cambios genéticos parece ser responsable de algunos rasgos importantes que, en conjunto, representan el fenotipo neoplásico completo (Hunter, Cell 64: 1129 [1991] y Bishop, Cell 20 64: 235-248 [1991]).

Un mecanismo bien conocido del exceso de expresión génica (por ejemplo, del oncogén) en células cancerosas es la amplificación génica. Se trata de un proceso en el que se producen múltiples copias de un gen particular en los cromosomas de las células ancestrales. El proceso implica la replicación descontrolada de la región del cromosoma que comprende el gen, seguido por la recombinación de los segmentos replicados de nuevo a los 25 cromosomas (Alitalo y col., Adv. Cancer Res. 47: 235-281 [1986]). Se cree que la expresión en exceso del gen es paralela a la amplificación génica, es decir, es proporcional al número de copias realizadas.

Se han identificado protooncogenes que codifican factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento que juegan importantes papeles en la patogénesis de diversas neoplasias malignas humanas, entre las que se incluye el cáncer de mama. Por ejemplo, se ha encontrado que el gen ErbB2 humano (erbB2, conocido también 30 como her2, o c-erbB-2), que codifica un receptor de una glicoproteína transmembrana de 185 kd (p185HER2; HER2) relacionado con el receptor EGFR del factor de crecimiento epidérmico), se expresa en exceso en aproximadamente de un 25% a un 30% de los cánceres de mama humano (Slamon y col., Science 235: 177-182 [1987]; Slamon y col., Science 244: 707-712 [1989]).

Se ha informado de que la amplificación génica de un protooncogén es un episodio típicamente implicado 35 en las formas más malignas de cáncer, y podría actuar como predictora del resultado clínico (Schwab y col., Genes Chromosomes Cancer 1: 181-193 [1990]; Alitalo y col., más arriba). De esta manera, la expresión en exceso de erbB2 se considera habitualmente un predictor de mal pronóstico, especialmente en pacientes con enfermedad primaria que implica los nódulos linfáticos axilares (Slamon y col., [1987] y [1989], más arriba; Ravdin y Chamness, Gene 159: 19-27 [1995]; y Hynes y Stern, Biochim Biophys Acta 1198: 165-184 [1994]), y se ha relacionado con la sensibilidad y/o la 40 resistencia a la terapia hormonal y a las pautas quimioterapéuticas, entre las que se incluyen CMF (ciclofosfamida, metotrexato, y fluoroacilo) y antraciclinas (Baselga y col., Oncology 11 (3 Suppl 1): 43-48 [1997]). Sin embargo, a pesar de la asociación de la expresión en exceso de erbB2 con un mal pronóstico, las probabilidades de que los pacientes HER2-positivos respondan clínicamente al tratamiento con taxanos fueron tres veces mayores que las de los pacientes HER2-negativos (Ibíd). Un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante dirigido contra ErbB2 (dirigido contra HER-45 2) (una versión humanizada del anticuerpo 4D5 de murino dirigido contra ErbB2 denominado como rhuMAb HER2 o HeceptinTM) ha estado clínicamente activo en pacientes con cáncer de mama metastásico con sobreexpresión de ErbB2 que habían recibido extensa terapia anticancerosa previa. (Baselga y col., J. Clin. Oncol. 14:737-744 [1996]).

Se clonó inicialmente ADAM8 de murino (conocido también como MS2 y mCD156) a partir de macrófagos y de líneas celulares de macrófagos y se ha descrito como un antígeno celular superficial. (Yoshida, S., y col (1990) Intl 50 Immunology 2: 585-591). Aunque no se reconoció inicialmente, mADAM8 tiene una estructura que se asemeja al

dominio de la metaloproteinasa de las proteínas hemorrágicas del veneno de serpiente del lado del extremo amino de una región rica en cisteína y puede jugar un papel en la infiltración tisular de células mielomonocíticas (Higuchi, Y. y col. (1996) Tissue Antigens 48: 423; Kataoka, M. y col (1997) J. Biol Chem 29: 18209-18215) Se ha clonado ADAM8 humano (hADAM8, conocido también como hCD156) y se ha cartografiado el gen correspondiente del cromosoma 10q26.3. 5

Se aisló ADAM8 humano a partir de monocitos humanos (Immunology Today, vol 20, 1999, pg 278-284). Se han usado anticuerpos para detectar ADAM-8 en linajes mielomonocíticos humanos (Leucocyte Typing V White Cell Differentiation Antigens, 1995, p 1091-1093 and Tissue Antigens vol. 48, 1996 p. 423). hADAM8 presenta un 61,7% de homología con mADAM8 y presenta dominios de desintegrina y metaloproteinasa. (Yoshiyama, K. y col (1997) Genomics 41: 56-62). Se ha informado también de una inducción potenciada de la tolerancia del péptido ADM8 en un 10 modelo de rata de autoinmunidad generalizada del sistema nervioso. (Schluesener, H. (1998) J Neuroimmunology 87: 197-202).

El documento WO 9740072 describe proteínas ADAM12 y sus usos.

A la luz de lo anterior, existe un interés obvio en la identificación de procedimientos y composiciones novedosos que sean útiles para el diagnóstico y el tratamiento de tumores que se asocian con la amplificación génica. 15

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento del crecimiento y la proliferación de células neoplásicas en mamíferos, que incluye seres humanos. La presente invención se basa en la identificación de un gen que está amplificado en el genoma de las células tumorales. Dicha amplificación génica está asociada con la expresión en exceso del producto génico y contribuye a la tumorigénesis. Según esto, las 20 proteínas codificadas por los genes amplificados son dianas útiles para el diagnóstico y/o el tratamiento (que incluye la prevención) de algunos cánceres, y actúan como predictoras del pronóstico del tratamiento del tumor.

Aunque los técnicos que clonaron la molécula de murino no lo reconocieron inicialmente, ADAM8 contiene una metaloproteasa y un dominio de la desintegrina. Se aisló también como un antígeno presente en monocitos De esta manera, se cree que ADAM8 juega un papel en la migración de los monocitos a través de la matriz extracelular o quizá 25 en el procesamiento de las citocinas u otras moléculas quimiotácticas. El aumento en la expresión de ADAM8 en células tumorales, en el estroma adyacente a las células tumorales o en las células epiteliales, por ejemplo, proporciona un medio por el cual las células tumorales pueden migrar a través de la matriz extracelular o las citocinas del proceso u otras moléculas quimiotácticas. El aumento en la expresión de ADAM8 en o cerca de las células tumorales proporciona, por tanto, un medio por el cual las células tumorales invaden el tejido o forman metástasis. Hacer diana en dicha 30 molécula con un anticuerpo u otra molécula que bloquee, inactive o incapacite de otra manera la capacidad de las células tumorales para moverse al interior o al exterior del tejido da como resultado una terapéutica...

1. Un procedimiento para diagnosticar un neoplasma que tiene una expresión en exceso de ADAM8 en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento detectar la expresión en exceso de un gen que codifica un polipéptido ADAM8 en una célula de ensayo obtenida del mamífero.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende detectar el nivel de expresión de un gen que 5 codifica un polipéptido ADAM8 (a) en una muestra de ensayo obtenida del mamífero y (b) en una muestra control procedente de un tejido normal conocido del mismo tipo de célula, en la que un mayor nivel de expresión en la muestra de ensayo es indicativo de un neoplasma que tiene una expresión en exceso de ADAM8 en el mamífero a partir del cual se obtuvieron las células del tejido de ensayo.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende (a) poner en contacto un anticuerpo dirigido 10 contra ADAM8 con una muestra de ensayo de células del tejido obtenido del mamífero, y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo dirigido contra ADAM8 y un polipéptido ADAM8 en la muestra de ensayo con el fin de detectar el nivel del polipéptido ADAM8, en el que un mayor nivel de polipéptido ADAM8 en la muestra de ensayo con respecto a una muestra del control de las células del tejido normal del mismo tipo de células es indicativo de un neoplasma que tiene expresión en exceso de ADAM8 en el mamífero a partir del cual se obtuvieron las células del tejido 15 de ensayo.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo está marcado de manera detectable.

5. El procedimiento de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en el que dicha muestra de ensayo de las células del tejido se obtiene a partir de un individuo sospechoso de tener enfermedad neoplásica.

6. Uso in vitro de un anticuerpo dirigido contra ADAM8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra ADAM8 o 20 una sonda de ácido nucleico que se hibrida a una molécula de ácido nucleico que codifica ADAM8 para el diagnóstico de un neoplasma que tiene una expresión en exceso de ADAM8 en un mamífero.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que el neoplasma es un cáncer de mama, pulmón, próstata o colon.

8. Uso in vitro de un anticuerpo dirigido contra ADAM8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra ADAM8, o un ácido nucleico de sentido contrario de ADAM8 para inhibir el crecimiento de células neoplásicas que expresan 25 ADAM8 en exceso.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que dichas células neoplásicas comprenden células cancerosas de mama, pulmón, próstata, o colon.

10. Uso de un anticuerpo dirigido contra ADAM8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra ADAM8, o un ácido nucleico de sentido contrario de ADAM8, en la fabricación de un medicamento para tratar un neoplasma que tiene 30 expresión en exceso de ADAM8.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que el neoplasma es un cáncer de mama, pulmón, próstata, o colon.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 35

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que el fragmento de anticuerpo se selecciona entre el grupo constituido por diacuerpos, anticuerpos lineales, fragmentos de Fv, scFv, Fab, Fab‟, y F(ab‟)2.

15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en el que el anticuerpo es un anticuerpo 40 humanizado o un fragmento de anticuerpo.

16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está conjugado con un agente citotóxico.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que el agente citotóxico comprende un isótopo radioactivo.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que el isótopo radioactivo se selecciona entre 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 45 186Re.

19. Uso según la reivindicación 16 en el que el agente citotóxico comprende un agente quimioterapéutico.

20. El uso según la reivindicación 19, en el que el agente quimioterapéutico se selecciona entre doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido, ciclofosfamida, tiotepa, busulfano, citoxina, paclitaxel, doxetaxel, toxotero, metotrexato, cisplatino, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, 5 esperamicinas, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, actinomicina D, VP-16, clorambucilo y melfalano.

21. El uso según la reivindicación 16, en el que el agente citotóxico comprende una toxina.

22. El uso según la reivindicación 21, en el que la toxina se selecciona entre una cadena de la difteria A, un fragmento activo no unido de la toxina de la difteria, la toxina del cólera, la toxina botulínica, una cadena de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, una cadena de ricina A, una cadena de abrina A, una cadena de modecina A, una alfa 10 sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de la diantina, las proteínas PAPI, PAPII, PAP-S, de Phytolaca americana, la curcina, la crotina, la saporina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina, tricotecenos, una caliqueamicina, un maitansinoide, la palitoxina, y CC1065.

23. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 22, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de un neoplasma en combinación con radioterapia o de un agente quimioterapéutico adicional. 15

24. Un anticuerpo dirigido contra ADAM8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra ADAM8, o un ácido nucleico de sentido contrario de ADAM8 para uso en el tratamiento de un neoplasma que tiene una expresión en exceso de ADAM8.