ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-CD20.

La presente invención se relaciona con un anticuerpo monoclonal dirigido al antígeno CD20 humano. La presente invención se relaciona adicionalmente con un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico y un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado producido por recombinación de genes, así como también un agente terapéutico para un tumor mediado por células B o una enfermedad inmunológica que contiene cualquiera de estos anticuerpos como un ingrediente activo. Técnica Antecedente Se conocen anticuerpos monoclonales que reconocen el antígeno CD20, B1, 2B8 (el nombre del anticuerpo quimérico es rituximab), 1F5, 2H7 y así sucesivamente. Por encima de todo, el rituximab, un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico desarrollado por IDEC Pharmaceuticals Corporation, U.S., se ha establecido como un agente terapéutico estándar para linfoma no Hodgkin de baja malignidad (NHL), y se encuentra que tiene un efecto terapéutico en muchas enfermedades inmunológicas mediadas por células B. Por ejemplo, se dice que es efectiva para, en adición a tumores malignos tal como leucemia linfática crónica, enfermedad autoinmunes en las que un autoanticuerpo patogénico parece estar involucrado tal como anemia hemolítica autoinmune y púrpura trombocitopénica idiopática, y enfermedades inflamatorias tal como artritis reumatoide crónica y esclerosis múltiple (Documentos de no patente 14 a 17). El CD20 es una molécula presente en la superficie celular de linfoma B y su expresión se ve en células B normales en sangre periférica, bazo, amígdala y médula ósea y así sucesivamente, así como también células B en la mayoría de tumores malignos. Esta molécula que comprende 297 residuos de aminoácido, penetra una membrana celular cuatro veces, y tiene el terminal C y el Terminal N dentro de la célula, y tiene solo el bucle extracelularmente expuesto con una cadena sin azúcar que consiste de 43 residuos de aminoácido entre el tercer y cuarto dominios de transmembrana (Documentos de no patente 1 y 9). Se considera que la molécula CD20 existe usualmente como un tetrámero, y forma adicionalmente un heterocomplejo con otros componentes menores (Documento no patente 18). Debido a que la proteína CD20 no se secreta de la célula o se divide, y adicionalmente, se toma fuertemente dentro de la célula mediante la unión del anticuerpo, se puede esperar que un mecanismo citotóxico basado en un anticuerpo dirigido contra una célula objetivo trabaje efectivamente (Documentos de no patente 1 a 3). A pesar de su tamaño molecular pequeño, el CD20 muestra diversidad de epítopo parcialmente debido al efecto de su forma de expresión como un complejo fuera de la célula, y la unión de los anticuerpos a sus varias diferentes respuestas biológicas mediatas. Por ejemplo, las actividades tal como regulación por disminución de los receptores de célula B, el incremento de las expresiones de los antígenos MHC clase II y las moléculas de adhesión, la activación de la liberación de Ca 2+ en la presencia de hiper-reticulación, la inhibición de antígeno 1 asociado a la función de linfocito no dependiente de adhesión homotípica, la inducción de apoptosis y la actividad opuesta, la promoción del crecimiento celular, varían significativamente (Documentos de no patente 4 a 13). Los ejemplos típicos del anticuerpo anti-CD20, rituximab, B1, 1F5 y 2H7, también tienen diferentes características y funciones biológicas, y una referencia a un "anticuerpo monoclonal que se une al CD20" no especifica solo sus propiedades biológicas. La molécula que constituye el dominio extracelular de CD20 es insoluble. Aunque la molécula CD20 derivada de un lisato celular o como una proteína de gen recombinante se puede solubilizar al utilizar un tensoactivo o álcali fuerte, es difícil mantener la estructura tridimensional natural bajo tal una condición de tratamiento. Por lo tanto, se utiliza una célula B positiva CD20 como un inmunógeno para obtener anticuerpos. Sin embargo, su propiedad inmunoestimuladora es débil, y no es fácil obtener clones de células que producen el anticuerpo maduro. Desde 2005, el rituximab, un anticuerpo quimérico de ratón/humano, es el único anticuerpo monoclonal anti-CD20 aprobado como un agente terapéutico. Debido a que las moléculas quiméricas con moléculas heterólogas tienen antigenicidad, ellas no se prefieren generalmente como agentes terapéuticos. Sin embargo, los anticuerpos anti- CD20 tienen una propiedad de objetivar y eliminar todas las células B que incluyen células normales, y por lo tanto se dice que ellas no tienen sustancialmente antigenicidad. Sin embargo, se han reportado ejemplos en los cuales se induce un anticuerpo neutralizante durante el periodo de tratamiento, aunque ellos cuentan solo varios porcentajes, y más fácilmente se induciría dependiendo de la dosis y el periodo de dosificación. Por lo tanto, se desea el desarrollo de un anticuerpo humanizado que tiene una secuencia más cerrada a aquella del anticuerpo humano o un humano. Otra desventaja de los anticuerpos quiméricos es la vida útil corta de la sangre, y la vida útil ß es solo 3 o 4 días. El índice efectivo del rituximab solo contra la recurrencia de NHL de baja malignidad es muy inferior de 50% en un estudio clínico con los Estados Unidos, que indica que 50% o más de los pacientes no responden o responden pobremente al rituximab. El índice de respuesta en los pacientes con malignidad NHL moderada es aún menor, 2   siendo solo aproximadamente 30% (Documento no patente 14). Por lo tanto, es necesario investigar los factores y el antecedente de las diferentes respuestas en los pacientes, y se desea al mismo tiempo el desarrollo de un anticuerpo que tiene un efecto superior. Documento no patente 1: Leukocyte Fact Book 2nd Edition, Academic Press Documento no patente 2: Stashenko P et al., J. Immunol., 1980, 125: 1678-85 Documento no patente 3: Anderson KC et al., Blood, 1984, 63: 1424-33 Documento no patente 4: Shan D et al., Blood, 1998, 91: 1644-52 Documento no patente 5: Flieger D et al., Cell Immunol., 2000, 204: 55-63 Documento no patente 6: Mathas S et al., Cancer Res., 2000, 60: 7170-6 Documento no patente 7: Cardarelli PM et al., Cancer Immunol. Immunother., 2002, 51: 15-24 Documento no patente 8: Pedersen IM et al., Blood, 2002, 99: 1314-9 Documento no patente 9: Deans JP et al., Immunol., 2002, 107: 176-82 Documento no patente 10: Golay JT et al., J. Immunol., 1992, 149: 300-8 Documento no patente 11: Bourger I et al., Eur. J. Immunol., 1993, 23: 768-71 Documento no patente 12: White MW et al., J. Immunol., 1991, 146: 846-53 Documento no patente 13: Shan D et al., Cancer Immunol. Immnother., 2000, 48: 673-83 Documento no patente 14: Coiffier B et al., Blood, 1998, 92: 1927-32 Documento no patente 15: Edward JC et al., Rheumatology (Oxford), 2001, 40: 205-11 Documento no patente 16: Zaja F et al., Heamatologica, 2002, 87: 189-95 Documento no patente 17: Perrotta S et al., Br. J. Haematol., 2002, 116: 465-7 Documento no patente 18: Polyak MJ et al., Blood, 2002, 99: 3256-62 La WO 2005/000901 describe anticuerpos monoclonales que se unen a CD20 y composiciones farmacéuticas que contienen los mismos. La WO 03/068821 describe anticuerpos anti-CD20 humanos, quiméricos y humanizados y las proteínas de fusión del anticuerpo CD20 que se unen a CD20. Descripción de la Invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que tenga funciones biológicas superiores a aquellas de los agentes terapéuticos de anticuerpo monoclonal anti-CD20 convencionales. Los inventores de la presente invención obtienen anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino que se unen específicamente al antígeno CD20 humano al utilizar dos o más cepas de célula B positivas para antígeno CD20, células de mamífero hechas biotecnológicamente para expresar el antígeno CD20 humano en sus membranas celulares, y la proteína CD20 humana fusionada con la proteína glutationa S-transferasa (GST) en una combinación arbitraria como un inmunógeno. Algunos de ellos tienen actividades directas inhibidoras de crecimiento celular que incluyen apoptosis en un cultivo celular que expresa CD20 in vitro sin células efectoras. Adicionalmente, independientemente de la presencia o ausencia de las actividades inhibidoras del crecimiento celular tal como apoptosis, estos anticuerpos, que incluyen otros anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino seleccionados, se imparten con citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo o complemento efectivo mediante quimerización. Al humanizar las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos determinados por tener la mayoría 3   de actividades biológicas deseables entre ellos, se preparan los anticuerpos monoclonales anti-CD20 que se pueden utilizar como un agente terapéutico. Así, se ha llevado a cabo la presente invención. La presente invención... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 de murino que tiene actividades inhibidoras de crecimiento celular que incluyen apoptosis contra células que expresan el antígeno CD20 humano en el cultivo de células que expresan el antígeno CD20 sin células efectoras, en donde las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena H y la región variable de cadena L son la SEQ ID NOS: 2 y 8. 2. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con la reivindicación 1. 3. Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico, en donde se fusionan la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con la reivindicación 1 y la secuencia de aminoácidos de la región constante de inmunoglobulina humana. 4. Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado utilizando la secuencia de aminoácidos de la región variable CDR del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con la reivindicación 1 y una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina humana. 5. El anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado de acuerdo con la reivindicación 4, donde la combinación de secuenias de aminoácidos de la región variable de cadena H y la región variable de cadena L es una combinación de SEQ ID NOS: 19 y 23, SEQ ID NOS: 19 y 24, SEQ ID NOS: 19 y 25, SEQ ID NOS: 19 y 26, SEQ ID NOS: 20 y 23, SEQ ID NOS: 20 y 24, SEQ ID NOS: 20 y 25, SEQ ID NOS: 20 y 26, SEQ ID NOS: 21 y 23, SEQ ID NOS: 21 y 24, SEQ ID NOS: 21 y 25, SEQ ID NOS: 21 y 26, SEQ ID NOS: 22 y 23, SEQ ID NOS: 22 y 24, SEQ ID NOS: 22 y 25, o SEQ ID NOS: 22 y 26. 6. El anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que tiene citotoxicidad contra células que expresan el antígeno CD20 en la presencia de un complemento humano. 7. Una célula de mamífero aislada incorporada con una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6. 8. La célula de mamífero de acuerdo con la reivindicación 7, que es una célula CHO. 9. Un agente diagnóstico que comprende el anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 6, como un ingrediente activo. 10. Un agente terapéutico que comprende el anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 como un ingrediente activo. 29   Pcmv: Promotor citomegalovirus PAbgh: promotor de señal de adición polyA de gen de hormona de crecimiento bovino Psvd: mejorador de promotor de virus de simio 40 eliminado DHFR: cADN reductasa dihidrofolato de ratón Pasv: señal de poliadición de virus de simio 40 pBR322ori: origen de replicación en E. coli r Neo : marcador de selección en células de mamífero (resistencia G418) INrbg: intrón de ß-globina de conejo SPI: Péptido señal de cadena ligera de anticuerpo VL: cADN de región variable de cadena ligera de anticuerpo C : cADN de región constante de cadena ligera de anticuerpo SPh: péptido señal de cadena pesada de anticuerpo VH: cADN de región variable de cadena pesada de anticuerpo Cl cADN de región constante de cadena pesada l de anticuerpo   Pcmv: Promotor citomegalovirus INrbg: intrón de ß-globina de conejo PAbgh: promotor de señal de adición polyA de gen de hormona de crecimiento bovino r Neo : marcador de selección en células de mamífero (resistencia G418) Psvd: mejorador de promotor de virus de simio 40 eliminado DHFR: cADN reductasa dihidrofolato de ratón Pasv: señal de poliadición de virus de simio 40 pBR322ori: origen de replicación en E. coli Cebador CD20 5 Humano (SEQ ID NO: 13) Cebador CD20 3 Humano (SEQ ID NO: 14) 31   Secuencia de región V de cadena H Secuencia de región V de cadena H Secuencia de región V de cadena H Secuencia de región V de cadena H Secuencia de región V de cadena H Secuencia de región V de cadena H Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L Secuencia de región V de cadena L 32   Día de Cultivo 1 (anticuerpo 4 µ g/ml) Día de Cultivo 1 (anticuerpo 2 µ g/ml) onug onug in N in N Día de Cultivo 2 (anticuerpo 2 µ g/ml) 33 Día de Cultivo 2 (anticuerpo 4 µ g/ml) onug onugni in N N   Crecimiento celular (%) Prueba de inhibición de crecimiento celular Raji Actividad CDC (%) Cultivo 3 días Concentración de anticuerpo agregado Concentración de anticuerpo ( µ g/ml) 34     36   37