Uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico en una partícula retrovírica en una célula productora para generar un retrovirus de replicación defectuosa en una célula diana,

en el que la secuencia nucleotídica está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y en el que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16

Vectores de EIAV con codones optimizados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a usos para la seguridad de vectores retrovíricos capaces de suministrar genes terapéuticos para uso en terapia génica, y a nuevas secuencias nucleotídicas para dicho uso.

Antecedentes de la invención

Los vectores retrovíricos se usan ahora ampliamente como vehículos para suministrar genes en células. Su popularidad deriva del hecho de que son fáciles de producir y median la integración estable del gen que portan al genoma de la célula diana. Esto permite la expresión a largo plazo del gen suministrado (1).

Durante cierto tiempo, ha habido un considerable interés en el desarrollo de sistemas de vectores retrovíricos basados en lentivirus. Los lentivirus son un pequeño subgrupo de retrovirus complejos. Contienen, además de los genes retrovíricos habituales (gag, pol y env), genes que les permiten regular su ciclo de vida e infectar células que no se dividen (2). Los sistemas de vectores basados en ellos son por lo tanto de interés debido a su uso potencial en la transferencia de un gen de interés a células que no se dividen, tales como neuronas. Además, los vectores lentivíricos permiten la expresión muy estable a largo plazo del gen de interés. Este se ha demostrado que es por lo menos tres meses para células neuronales de rata transducidas, mientras que los vectores a base de MLV sólo fueron capaces de expresar el gen de interés durante seis semanas.

El lentivirus usado más habitualmente es el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), el agente etiológico del SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). Los vectores a base de VIH han demostrado que transducen eficazmente células que no se dividen (3), y se pueden usar, por ejemplo, para dirigir genes terapéuticos anti-VIH a células susceptibles al VIH.

Sin embargo, los vectores a base de VIH tienen un número de desventajas significativas que pueden limitar su aplicación terapéutica a ciertas enfermedades. En particular, VIH-1 es un patógeno humano que posee proteínas y secuencias potencialmente oncogénicas. Existe riesgo de que la introducción de partículas vectoriales producidas en células que se empaquetan, que expresan gag-pol de VIH, introducirá estas proteínas en el paciente, conduciendo a la seroconversión.

Por lo tanto, se ha puesto énfasis en la seguridad de estos vectores. Una estrategia se fija en el diseño de sistemas de producción para vectores retrovíricos. Un sistema de vector retrovírico consiste básicamente en dos elementos, una estirpe celular de empaquetamiento, y un genoma del vector. La estirpe de empaquetamiento más simple consiste en un provirus en el que se ha suprimido la secuencia ? (un determinante del empaquetamiento del ARN que en VIH se encuentra entre U5 y gag). Cuando se transfectan de forma estable en una célula, se producirán partículas víricas que contienen transcriptasa inversa, pero el ARN viriónico no se empaquetará dentro de estas partículas. El componente complementador en un sistema de vector retrovírico es el propio vector genómico. El vector genómico necesita contener una secuencia de empaquetamiento, pero gran parte de las regiones codificantes estructurales se pueden suprimir. A menudo se incorpora en el vector un gen marcador seleccionable, u otra secuencia nucleotídica de interés. Entonces, los lotes de vectores de la estirpe de empaquetamiento se pueden usar para infectar células diana. Si la célula es infectada con éxito por la partícula vírica, la secuencia del vector genómico se transcribirá de forma inversa y se integrará por la maquinaria retrovírica. Sin embargo, la infección es un proceso final, de forma que no debería ocurrir ninguna replicación o diseminación posterior del vector.

Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, se encuentran problemas en el diseño de vectores retrovíricos seguros y eficaces. Estos incluyen la posibilidad de que la recombinación entre el vector de empaquetamiento y la secuencia de empaquetamiento puede conducir a la generación de virus competente para la replicación de tipo salvaje. En consecuencia, se han realizado esfuerzos para mejorar la seguridad de los constructos de células de empaquetamiento.

En las estirpes celulares de empaquetamiento de segunda generación, además de la supresión de la secuencia de empaquetamiento, también se suprimió la 3'LTR, de forma que son necesarias dos recombinaciones para generar un virus de tipo salvaje.

En estirpes de empaquetamiento de tercera generación, los genes gag-pol y el gen env se colocan en constructos separados que se introducen secuencialmente en las células de empaquetamiento, para evitar la recombinación durante la transfección.

Con respecto a la señal de empaquetamiento, el documento EP 0.368.882A (Sodroski) describe que en VIH corresponde a la región entre el donante de corte y empalme principal de 5' y el codón de iniciación de gag, y particularmente corresponde a un segmento justo en dirección 3' del donante de corte y empalme principal de 5', y alrededor de 14 bases en dirección 5' del codón de iniciación de gag. Esta región es la que Sodroski enseña que se debe de suprimir del casete de gag-pol. El documento WO 97/12622 (Verma) describe que en VIH-1 se puede realizar una supresión interna de 39 pb en la secuencia ? entre el sitio donante de corte y empalme de 5' y el codón de partida del gen gag.

Se puede usar el bamboleo de codones para reducir la frecuencia de recombinación a la vez que se mantiene la secuencia proteica primaria de los constructos, véase (4) en el que la región de solapamiento entre los constructos de expresión de gag-pol y env se redujo hasta 61 pb que se extienden a lo largo de la región común entre pol y env que están en marcos de lectura diferentes. Se introdujeron mutaciones de transversión en los 20 codones finales de pol, reteniendo la integridad de la región codificante a la vez que se reduce la homología con env hasta 55% en la región de solapamiento. De forma similar, se introdujeron mutaciones de bamboleo en el 3' de env, y se suprimieron todas las secuencias en dirección 3' del codón de parada de env.

Los vectores eficientes contienen habitualmente parte de gag en el vector genómico, para incrementar el título de viriones. A diferencia de la secuencia de empaquetamiento que puede estar en cualquier posición dentro de una secuencia para efectuar el empaquetamiento, la secuencia de gag debe de estar en su posición nativa adyacente a ? para que tenga algún efecto.

Se apreciará que, mientras se pueden hacer mejoras significativas en el diseño de células de empaquetamiento y vectores, todavía hay alcance para un refinamiento adicional de las estirpes de empaquetamiento actuales.

Sumario de la invención

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar partículas retrovíricas, en particular partículas lentivíricas, y particularmente aquellas que poseen constructos nucleotídicos que codifican proteínas terapéuticas, que tengan seguridad mejorada con respecto a la partícula vírica de tipo salvaje correspondiente. En el documento WO 99/41397 se describe la optimización de codones de los genes gag-pol como un medio para superar el requisito de Rev/RRE para exportar y para potenciar la estabilidad de ARN. Sin embargo, ahora se ha encontrado que la secuencia de gag-pol con codones optimizados resuelve los problemas de recombinación potenciales con genomas vectoriales que poseen parte de una secuencia de gag con el objeto de incrementar el título. Esta estrategia también evita la necesidad de usar regiones de gag procedentes de diferentes virus en los constructos de empaquetamiento y de genomas vectoriales.

Otra ventaja significativa proporcionada por la invención es que la optimización de codones interrumpe las estructuras secundarias de ARN, tal como la señal de empaquetamiento, haciendo así al ARNm de gag-pol no empaquetable. De este modo, la presente invención permite que se retenga la secuencia retrovírica en dirección 5' del codón de iniciación de gag, en contraste con Sodroski y Verma, sin comprometer significativamente la seguridad.

Exposición de la invención

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona el uso de una secuencia nucleotídica que codifica las proteínas gag y pol retrovíricas, capaz de ensamblar un genoma...

1. Uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico en una partícula retrovírica en una célula productora para generar un retrovirus de replicación defectuosa en una célula diana, en el que la secuencia nucleotídica está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y en el que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.

3. Uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico en una partícula retrovírica en una célula productora para evitar el empaquetamiento del genoma del vector retrovírico en una célula diana, en el que la secuencia nucleotídica está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV; y la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.

4. Uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico, que comprende por lo menos parte de una secuencia nucleotídica de gag, en una partícula retrovírica en una célula productora para prevenir la recombinación entre dicha secuencia nucleotídica que codifica las proteínas retrovíricas gag y pol y la al menos parte de una secuencia nucleotídica de gag, en el que la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y en el que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el genoma retrovírico comprende además un nucleótido de interés (NOI).

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia nucleotídica es independiente de Rev.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia nucleotídica no contiene la secuencia de RRE.

9. Método para producir un retrovirus de replicación defectuosa, que comprende transfectar una célula productora con lo siguiente:

caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica de codones optimizados comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.

11. Método para evitar el empaquetamiento de un genoma retrovírico en una célula diana, que comprende las etapas siguientes:

caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica de codones optimizados comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.

13. Método para evitar la recombinación entre un genoma de vector retrovírico y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido vírico requerido para el ensamblaje del genoma vírico en partículas retrovíricas, que comprende transfectar una célula productora con lo siguiente:

caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica de codones optimizados comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que el genoma retrovírico comprende además un nucleótido de interés (NOI).

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que iii) comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína env.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que por lo menos uno de i) a iii) contiene uno o más genes accesorios funcionales.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que i) a iii) están desprovistos de cualesquiera genes accesorios funcionales.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, en el que la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas retrovíricas gag y pol es independiente de Rev.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 19, en el que la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas retrovíricas gag y pol no contiene la secuencia de RRE.

21. Secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol que comprende la secuencia de SEC ID nº: 16.

22. Vector que comprende una secuencia nucleotídica según la reivindicación 21, en el que el vector es independiente de Rev.

23. Sistema de vector vírico que comprende:

24. Sistema de producción vírico que comprende:

25. Sistema según la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en el que el vector vírico es un vector retrovírico.

26. Sistema según la reivindicación 25, en el que el vector retrovírico es un vector lentivírico.

27. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que el vector lentivírico deriva sustancialmente de EIAV.

28. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que la secuencia nucleotídica definida en i-ii) también incluye una proteína de cubierta.

29. Sistema según la reivindicación 28, en el que el gen de cubierta tiene codones optimizados.

30. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el que el nucleótido de interés se selecciona de entre un gen terapéutico, un gen marcador y un gen de selección.

31. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, que comprende uno o más genes accesorios funcionales.

32. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, desprovisto de cualesquiera genes accesorios funcionales.

33. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, en el que la secuencia nucleotídica (ii) no contiene la secuencia de RRE.

34. Sistema vírico según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, para uso en un método para producir partículas víricas.

35. Método para producir una partícula vírica, comprendiendo dicho método introducir en una célula productora:

36. Partícula vírica producida por el sistema de producción según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, o por el método según la reivindicación 35.

37. Sistema vírico según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34, o una partícula vírica según la reivindicación 36, para tratar una infección vírica.

38. Composición farmacéutica que comprende el sistema vírico según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34, o la partícula vírica según la reivindicación 37, junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.