Vector lentivírico.

Un genoma de vector multicistrónico derivable de un lentivirus para uso en un sistema de producción lentivíricoindependiente de rev para producir una partícula de vector derivada de lentivirus,

comprendiendo dicho genoma unaseñal de empaquetamiento, un marco de lectura abierto (ORF) heterólogo en 3' de una LTR vírica y en 5' de unpromotor, en el que el promotor controla la expresión de al menos un nucleótido de interés (NOI) en 3', y en el que elORF heterólogo está ligado operativamente con la LTR; en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el genauxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, ose retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el elemento de respuesta a Rev (RRE) está alterado de talmodo que dicho RRE no es funcional, o se retira del genoma de vector lentivírico, y en el que el vector lentivírico esun vector lentivírico autoinactivante.

Vector lentivírico La presente invención se refiere a un genoma de vector lentivírico, a un sistema de producción de vector lentivírico y a una partícula de vector lentivírico que comprende el genoma y particularmente, pero no exclusivamente, a su uso en terapia.

Los sistemas de vector retrovírico, tales como sistemas de vector lentivírico, se han propuesto como sistema de suministro para, entre otras cosas, la transferencia de un nucleótido de interés a uno o más sitios de interés. Es más, el concepto de uso de vectores víricos para terapia génica es bien conocido (Verma y Somia (1997) Nature 389: 239-242) . Los genomas retrovíricos contienen genes accesorios, tales como un gen rev, un gen tat, un gen vif, un gen nef, un gen vpr o un gen S2. La deleción de dichos genes accesorios, particularmente cuando se usan sistemas de vector retrovírico en terapia génica, es altamente ventajosa. En primer lugar, permite producir vectores sin los 15 genes asociados normalmente con enfermedades en infecciones retrovíricas (por ejemplo, VIH) . En segundo lugar, la deleción de los genes accesorios permite empaquetar al vector más ADN heterólogo. En tercer lugar, pueden omitirse los genes cuya función es desconocida, tales como dUTPase y S2, reduciendo por tanto el riesgo de causar efectos indeseables. Se ha enseñado anteriormente por los inventores, por ejemplo en el documento WO 98/17815, cómo retirar muchos de los genes accesorios. Adicionalmente en el documento WO 99/45126, los inventores describen la optimización de codones de la secuencia gag-pol como medio para intentar superar el requisito de Rev/RRE para exportación y para potenciar la estabilidad del ARN. Sin embargo, sigue habiendo la necesidad de proporcionar estrategias para la provisión de vectores víricos útiles y seguros y de medios eficaces para su producción. La presente invención se enfrenta a estos problemas y de forma particularmente ventajosa se dirige a proporcionar un sistema más seguro en el que los genes accesorios víricos, tales como rev, no sean necesarios en la partícula de vector vírico que se usa en el tratamiento ni en su producción.

Kingsman SM, FDA/BRMA 25-26 de octubre de 2001, es un conjunto de diapositivas titulado "Safety Features In The Design, Manufacture and Clinical Monitoring of Lentivectors For The Treatment Of Parkinson's Disease, Prostate Cancer and AIDS".

Fuller M y Anson DS, Human Gene Therapy, 2001, 12: 2081-2093 se refieren a plásmidos auxiliares para la producción de vectores derivados de VIH-1.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un genoma de vector multicistrónico derivable de un lentivirus para uso en un sistema de producción lentivírico independiente de rev para producir una partícula de vector derivada de lentivirus, comprendiendo dicho genoma una señal de empaquetamiento, un marco de lectura abierto (ORF) heterólogo en 3’ de una LTR vírica y en 5’ de un promotor, en el que el promotor controla la expresión de al menos un nucleótido de interés (NOI) en 3’ y en el que el ORF heterólogo está ligado operativamente con la LTR; en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, o se retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el elemento de respuesta a Rev (RRE) está alterado de tal modo que dicho RRE no es funcional, o se retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el vector lentivírico es un vector lentivírico autoinactivante.

Por tanto, los inventores han encontrado ahora que es posible proporcionar un vector vírico que sea independiente 45 de rev sin efecto perjudicial sobre el título vírico.

Preferiblemente, el genoma de vector es bicistrónico, tricistrónico o tetracistrónico.

En una realización, la primera secuencia de ácido nucleico es un resto informador o un marcador seleccionable.

En otra realización, la primera secuencia de ácido nucleico codifica un gen modulador.

Preferiblemente, el gen modulador se selecciona de represores de tetraciclina, tales como TetR, y transactivadores controlados por tetraciclina, tales como tTA y rtTA.

Preferiblemente, el represor de tetraciclina tiene optimización de codones para expresión en una célula de mamífero.

Preferiblemente, el represor de tetraciclina está ligado con una señal de localización nuclear.

En una realización preferida, el vector comprende más de un NOI en 3’ del promotor interno.

Preferiblemente, el NOI da lugar a un efecto terapéutico.

En una realización, uno o más de los NOI están ligados operativamente con un operador de tetraciclina.

En otra realización, el vector comprende un represor de tetraciclina adicional en 3’ del promotor interno.

Preferiblemente, el vector deriva de VIH-1, VIH-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV o lentivirus visna.

Preferiblemente, el vector deriva de un lentivirus no de primate. 5 Preferiblemente, el genoma de vector comprende una secuencia de cPPT.

Preferiblemente, el genoma de vector comprende un elemento regulador postranscripcional o un elemento traduccional.

Preferiblemente, los motivos ATG de la señal de empaquetamiento gag del genoma de vector lentivírico de tipo silvestre son motivos ATTG.

Preferiblemente, la distancia entre las regiones R del genoma de vector es sustancialmente la misma que en el 15 vector lentivírico de tipo silvestre.

Preferiblemente, la región 3' U3 del genoma de vector incluye la secuencia de un promotor vírico y/o eucariótico.

Preferiblemente, la región 3' U3 del genoma de vector incluye un promotor vírico y/o eucariótico de tipo silvestre.

Preferiblemente, el promotor vírico es una región U3 de EIAV o MLV.

Por tanto, según la presente invención, se proporciona un vector lentivírico en el que el vector tiene lo siguiente: los motivos ATG de la señal de empaquetamiento gag del vector lentivírico de tipo silvestre son motivos ATTG; la 25 distancia entre las regiones R del vector lentivírico es sustancialmente la misma que en el vector lentivírico de tipo silvestre y la región 3' U3 del vector lentivírico incluye secuencias de un promotor vírico y/o eucariótico. Preferiblemente, la región 3' U3 puede incluir secuencias de la región U3 de EIAV o MLV, u otros promotores víricos o eucarióticos. En una realización, la región 3’ U3 puede incluir promotores víricos o eucarióticos de tipo silvestre.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de producción de vector lentivírico para producir una partícula de vector derivado de lentivirus, comprendiendo dicho sistema un conjunto de secuencias de ácido nucleico que codifican los componentes del vector lentivírico, incluyendo el genoma de vector lentivírico de la presente invención, proteínas Gag y Pol y la proteína Env o un sustituto funcional de las mismas, y en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, o no está presente en el sistema de producción de vector lentivírico, y no se suministra en trans, y RRE está alterado de tal modo que RRE no es funcional, o no está presente en el sistema de producción de vector lentivírico, y no se suministra en trans.

Preferiblemente en el sistema, las secuencias de ácido nucleico que codifican al menos uno de los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef, o genes auxiliares análogos, del lentivirus del que derivan dichas partículas, están alteradas también de tal modo que dichos genes auxiliares son incapaces de codificar las proteínas auxiliares funcionales, o se retiran del sistema.

Preferiblemente, el vector deriva de VIH-1, VIH-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV o lentivirus visna.

Preferiblemente, el vector deriva de un lentivirus no de primate.

Preferiblemente, el conjunto de secuencias de ácido nucleico que codifican los componentes del vector incluye tres constructos de ADN que codifican el genoma de ARN del vector, las proteínas Gag y Pol y la proteína Env, o sustitutos funcionales de los mismos.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un constructo de ADN para uso en el sistema de la presente invención, codificando dicho constructo de ADN un genoma de vector de ARN empaquetable según la invención.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjunto de constructos de ADN para uso en el sistema de la invención que comprenden el constructo de ADN según la invención y un constructo de ADN que codifica las proteínas Gag y Pol o... [Seguir leyendo]

1. Un genoma de vector multicistrónico derivable de un lentivirus para uso en un sistema de producción lentivírico independiente de rev para producir una partícula de vector derivada de lentivirus, comprendiendo dicho genoma una 5 señal de empaquetamiento, un marco de lectura abierto (ORF) heterólogo en 3’ de una LTR vírica y en 5’ de un promotor, en el que el promotor controla la expresión de al menos un nucleótido de interés (NOI) en 3’, y en el que el ORF heterólogo está ligado operativamente con la LTR; en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, o se retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el elemento de respuesta a Rev (RRE) está alterado de tal

modo que dicho RRE no es funcional, o se retira del genoma de vector lentivírico, y en el que el vector lentivírico es un vector lentivírico autoinactivante.

2. El genoma de vector de la reivindicación 1, en el que el ORF heterólogo es un resto informador o marcador

seleccionable. 15

3. El genoma de vector de la reivindicación 1 o 2, en el que el ORF heterólogo codifica un gen modulador.

4. El genoma de vector de la reivindicación 3, en el que el gen modulador se selecciona de represores de tetraciclina

tales como TetR y transactivadores controlados por tetraciclina tales como tTa y rtTA. 20

5. El genoma de vector según la reivindicación 4, en el que el represor de tetraciclina tiene optimización de codones para expresión en una célula de mamífero.

6. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el genoma de vector es derivable 25 de un vector lentivírico no de primate.

7. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el genoma de vector es derivable de un lentivirus seleccionado del grupo consistente en HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CEV, CAEV, MVV y vector lentivírico visna.

8. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el genoma de vector comprende una secuencia de tramo central de polipurina (cPPT) .

9. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el genoma de vector 35 comprende un elemento regulador postranscripcional o un elemento traduccional.

10. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que todos los motivos ATG que derivan de gag y forman parte de la señal de empaquetamiento se han modificado para leer ATTG.

11. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el genoma de vector es bicistrónico, tricistrónico o tetracistrónico.

12. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el NOI es al menos una secuencia que codifica una enzima, citocina, quimiocina, hormona, anticuerpo, molécula antioxidante, molécula de 45 tipo inmunoglobulina genomanipulada, proteína de fusión, molécula coestimuladora inmunitaria, molécula inmunomoduladora, ARN anticodificante, mutante negativo transdominante de una proteína diana, toxina, toxina condicional, antígeno, proteína supresora tumoral, factor de crecimiento, proteína de membrana, proteína vasoactiva, proteína antivírica, ribozima o proteína activadora de profármaco.

13. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el NOI es útil en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.

14. El genoma de vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el NOI codifica un factor

neuroprotector. 55

15. El genoma de vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el NOI es útil en el tratamiento de uveítis posterior, uveítis intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveoretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, retinitis o edema macular quistoide, oftalmía simpática, escleritis, retinitis pigmentosa, componentes inmunitarios e inflamatorios de enfermedad degenerativa de fondo de ojo, componentes inflamatorios 60 de traumatismo ocular, inflamación ocular causada por infección, vitreorretinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva tal como después de operación de filtración de glaucoma, reacción inmunitaria y/o inflamatoria contra implantes oculares y otras enfermedades oftálmicas relacionadas con el sistema inmunitario y la inflamación, enfermedades angiogénicas oculares tales como retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular y

rubeosis.

16. Un sistema de producción de vector lentivírico para producir una partícula de vector derivada de lentivirus, comprendiendo dicho sistema un conjunto de secuencias de ácido nucleico que codifican los componentes del genoma de vector incluyendo el genoma de vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, proteínas Gag y Pol y proteína Env o un sustituto funcional de las mismas, y en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el

gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional,

o no está presente en el sistema de producción de vector lentivírico y no se suministra en trans, y el RRE está alterado de tal modo que dicho RRE no es funcional, o no está presente en el sistema de producción de vector lentivírico, y no se suministra en trans.

17. El sistema de producción según la reivindicación 16, en el que el conjunto de secuencias de ácido nucleico comprende tres constructos de ADN que codifican (i) el genoma de vector lentivírico, (ii) Gag y Pol y (iii) Env.

18. El sistema de producción según las reivindicaciones 16 o 17, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica Gag y Pol tiene optimización de codones. 15

19. El sistema de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que las secuencias de ácido nucleico que codifican al menos uno de los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef, o genes auxiliares análogos, del lentivirus del que derivan dichas partículas, están también alteradas de tal modo que dichos genes auxiliares son incapaces de codificar las proteínas auxiliares funcionales, o se retiran del sistema.

20. Un constructo de ADN para uso en el sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, codificando dicho constructo de ADN un genoma de vector de ARN empaquetable como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

21. Un conjunto de constructos de ADN que comprende el constructo de ADN según la reivindicación 20 y un constructo de ADN que codifica Gag y Pol como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.

22. El conjunto de constructos de ADN según la reivindicación 21, que comprende adicionalmente un constructo de ADN que codifica Env o un sustituto funcional de la misma. 30

23. Un proceso para preparar una partícula de vector lentivírico que comprende introducir un conjunto de secuencias de ácido nucleico o constructos de ADN como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 en una célula hospedadora, y obtener una partícula de vector lentivírico.

24. Una partícula de vector lentivírico producida mediante el sistema, constructo de ADN o conjunto de constructos de ADN o proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23.

25. Una partícula de vector derivado de lentivirus que comprende un genoma de vector como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, proteínas Gag y Pol y proteína Env, o un sustituto funcional de las mismas. 40

26. Una célula transducida con la partícula de vector lentivírico de la reivindicación 24 o 25 o un constructo de ADN o un conjunto de constructos de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22.

27. Una partícula de vector lentivírico de la reivindicación 24 o 25 o un constructo de ADN o un conjunto de

constructos de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 o una célula de la reivindicación 26 para uso en medicina.

28. Una composición farmacéutica que comprende el genoma de vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, el constructo de ADN o conjunto de constructos 50 de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, una partícula de las reivindicaciones 24 o 25 o una célula de la reivindicación 26, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

29. Uso de una partícula de vector lentivírico de la reivindicación 24 o 25, o un constructo de ADN o conjunto de constructos de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, o una célula de la reivindicación 26, para la 55 preparación de un medicamento para suministrar un NOI a un sitio diana necesitado del mismo.

30. El uso de la reivindicación 29, en el que el NOI es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

31. Un sistema de suministro en forma de una partícula de vector lentivírico de la reivindicación 24 o 25, o un constructo de ADN o conjunto de constructos de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, o una célula de la reivindicación 26, para uso en medicina.

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5 Figura 6 Figura 7

Figura 8

Figura 11

Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15

Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22