Péptidos para detectar estirpes de lentivirus.

La presente invención describe una serie de péptidos que se corresponden con sitios antigénicos nuevos,

de estirpes Españolas de virus del grupo LVPR (género Lentivirus), en concreto estirpes de las regiones geográficas de Castilla-León, Aragón y Navarra de los tipos filogenéticos B (frecuentemente implicados en la enfermedad artrítica), A (comúnmente responsables de las formas pulmonar o nerviosa). Estos péptidos son útiles para el diagnóstico de la infección por LVPR, por tanto la presente invención describe también nuevos métodos de diagnóstico in Vitro de la infección por LVPR y kits o dispositivos de ensayo para su ejecución.

PÉPTIDOS PARA DETECTAR ESTIRPES DE LENTIVIRUS Campo de la técnica

La presente invención se encuadra dentro de las

aporta una nueva herramienta biotecnológica para la ayuda al diagnóstico de infecciones por estirpes españolas de campo de los lentivirus del ganado ovino y caprino (LVPR) . Por lo tanto, la presente invención se encuadra también entre aquellas herramientas biotecnológicas que proporcionan métodos de control de las estirpes más peligrosas y patógenas de LVPR que aparecen en determinadas áreas geográficas.

Estado de la técnica

Los lentivirus de pequeños rumiantes (LVPR) , que incluyen el virus (VMV) y el de la artritis encefalitis caprina (VAEC) , son un grupo de virus muy heterogéneo desde un punto de vista genético y antigénico que afectan al ganado ovino y caprino (pequeños rumiantes) causando una infección multisistémica, caracterizada por la presencia de inflamación e infiltración linfocitaria, generalmente en mama, pulmones, articulaciones y encéfalo (Reina et al., 2009a) . La transmisión natural ocurre de madres a hijos por vía lactogénica o entre animales adultos por medio de secreciones o aerosoles (Blacklaws et al., 2004) Además se ha descrito transmisión de ovej as a cabras y viceversa, especialmente en rebaños mixtos (Gjerset et al., 2007; Grego et al., 2007; Pisoni et al., 2005; Shah et al., 2004) . Actualmente los LVPR se clasifican según estudios

filogenéticos en 5 genotipos (A-E) . El genotipo A engloba las estirpes pertenecientes al VMV clásico causantes generalmente de neumonía intersticial y encefalitis, el genotipo B las pertenecientes al clásico VAEC

(Gjerset et al., 2009) , el genotipo D tan solo presente en Suiza y España (Reina et al., 2006; Shah et al., 2004) , Y el genotipo E presente sólo en caprinos italianos (Grego et al., 2007; Reina et al., 2009b; Reina et al., 2009c) .

El diagnóstico temprano es una herramienta clave para el control de las enfermedades infecciosas, también en aquéllas por LVPR siempre conducentes a la muerte del animal. El hospedador genera frente al virus una respuesta de anticuerpos indicadora de infección. Éstos se detectan generalmente mediante el empleo de ELISA, aunque su combinación con Western blot (WB) se ha empleado en numerosas publicaciones para establecer el estado infeccioso de un animal (gold estándar) (de Andres et al., 2005; Reina et al., 2009d) .

El uso de la PCR o RT-PCR, que detectan directamente provirus y RNA viral respectivamente en células infectadas, ha sido útil como complemento al ELISA ya que permite una detección temprana de la infección así como la posibilidad de detectar animales infectados pero seronegativos (Alvarez et al., 2006; Gonzalez et al., 2005; Herrmann-Hoesing et al., 2007) . Esto es posible gracias a la capacidad de los lentivirus de retrotranscribir su genoma en ADN e integrarlo en el genoma de la célula infectada en forma de provirus. Aunque con estas técnicas detectamos directamente la presencia de ácidos nucleicos virales, la enorme variabilidad genética de los LPVR hace que la detección por

PCR no sea siempre posible. La clasificación de los LVPR en cinco grupos genéticos nos da una idea de la variabilidad presente. Por otro lado, aproximadamente tan solo 1 de cada millón de monocitos en circulación se encuentran infectados, así la baj a carga proviral o viral, existente con frecuencia, dificulta las posibilidades de encontrar una diana amplificable (de Andres et al., 2005) .

Muchos grupos han centrado sus esfuerzos en encontrar un "gold standard" que identifique con certeza los positivos y los negativos para el diagnóstico de LVPR y permita estandarizar las diferentes técnicas serológicas. En ausencia de dicho estándar se ha venido empleando como criterio de infección la positividad a dos técnicas de diagnóstico ya sea serológico o virológico (Varea et al., 2 O O 1) . A los efectos de esta patente, el término "gold standard", se define como el método de referencia para el diagnóstico de las infecciones de ganado atribuibles a lentivirus, con el que se van a comparar en cuanto a sensibilidad, falsos positivos y falsos negativos, el resto de métodos y kits de diagnóstico existentes en el estado de la técnica.

El diagnóstico serológico de una infección lentiviral presenta algunos inconvenientes. En primer lugar, en estas infecciones la cantidad de antígeno viral que se expone al sistema inmune es variable y frecuentemente bajo, desencadenando respuestas fluctuantes y débiles (de Andres et al., 2005) . Por otro lado, pueden pasar varias semanas desde la infección natural hasta la seroconversión (esto es, la aparición de anticuerpos específicos en sangre, detectables por las técnicas serológicas de diagnóstico) . Sin embargo, el mayor inconveniente es la diversidad antigénica que presentan los LVPR. Por ejemplo, se ha descrito que antígenos derivados del genotipo A son capaces de detectar anticuerpos producidos durante la infección por genotipo B, pero no al contrario (Lacerenza et al., 2006) . Recientemente, se ha descrito que la seroprevalencia (esto es, la proporción de individuosinfectados seropositivos, determinada a partir de los resultados obtenidos mediante los tests de diagnóstico serológico) del genotipo E podría estar subestimada, ya que los ELISAs comerciales empleados en los programas de control no son capaces de detectarlo

(Reina et al., 2009d) .

Existe un gran número de publicaciones que describen diferentes procedimientos ELISA para detectar la infección por LVPR, aunque pocos de estos ensayos han sido validados al nivel internacional. Dichos procedimientos pueden clasificarse en tres grupos, aquéllos que usan como antígeno virus completo, los que usan proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos y los ELISAs competitivos basados en el uso de anticuerpos monoclonales

con diferentes agentes químicos para luego tapizar los pocillos y se comparan diferentes tests para relativizar los valores de sensibilidad y especificidad. El único disponible es el Chekit, comercializado por Bommeli AG

(Zanoni et al., 1994) .

Los tests que utilizan proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos abarcan un gran abanico de antígenos, tanto de proteínas del núcleo viral, GAG: p55, p25, p16 y p14; como de proteínas de la envoltura viral, ENV: gp46

(TM) Y gp135 (SU) .En el caso de péptidos sintéticos, se han sintetizado péptidos de p25, p17 y de TM. La sensibilidad de estos ELISAs varía considerablemente, siendo ésta en

algunos de ellos menor de un 40%, llegando en otros al 100%. La especificidad es siempre elevada. Los ELISAs recombinantes que incluyen antígenos del núcleo viral (GAG) y de 1 a envo 1 tu ra (ENV) resultan ser equivalentes en sensibilidad y por el contrario algo más específicos (de Andres et al., 2005) . Hyphen Biomed comercializa un ELISA recombinante (Elitest) basado en la proteína p25 y un péptido sintético de gp46 (Saman et al., 1999) , de elevada sensibilidad y especificidad en algunos estudios (Perez et al., 2009; Saman et al., 1999; Varea et al., 2001) , si bien su espectro antigénico podría ampliarse (Ramirez et al., 2009) . Por su parte, el Institut Pourquier comercializa un ELISA con formulación equivalente, tapiza los pocillos con las proteínas de fusión p25-gp46, siendo en algunos estudios la sensibilidad de este test alta (Reina et al., 2009d) Y en otros limitada (Ramirez et al., 2009) . Existen publicaciones adicionales recientes en las que se comparan los tests comerciales existentes en diferentes zonas de Europa (Brinkhof and van Maanen, 2007; Toft et al., 2007) .

Los ELISAs de competición se... [Seguir leyendo]

1 . -Péptido que comprende un fragmento inmunogénico de una estirpe Española de un virus LVPR a elegir entre los subtipos filogenéticos B2 artrítica, A pulmonar o A2 nerviosa y que comprende una secuencia de aminoácidos a elegir entre: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11 o SEQ ID No. 12 y/o combinaciones de los mismos.

2. péptido, según la reivindicación 1, caracterizado porque es específico de la estirpe de campo CastellanoLeonesa A2 nerviosa del LVPR.

3. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones ó 2 compuesto por, al menos, 15 aminoácidos.

4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID No: 8

5. Uso de alguno de los péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos a elegir entre: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11 o SEQ ID No. 12, o combinaciones de los mismos, para fabricar un test diagnóstico in vitro para la infección por LVPR.

6. Uso de alguno de los péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos a elegir entre: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11 o SEQ ID No. 12 o

combinaciones de los mismos para fabricar una vacuna contra las infecciones causadas por LVPR

7. Composición peptídica basada en una combinación de péptidos que comprende al menos un péptido de la reivindicación 1 y al menos otro péptido que comprende una secuencia de aminoácidos a elegir entre: SEQ ID No.6, SEQ ID No. 9 o SEQ ID No lO.

8. -Composición peptídica según la reivindicación 7 que comprende al menos dos péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos a elegir entre: SEQ ID No. 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9.

9. Uso de una composición peptídica según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para fabricar un kit de diagnóstico in vitro para la infección por LVPR.

10. Uso de una composición peptídica según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para fabricar una vacuna contra la infección por LVPR.

11. Acido nucleico que codifica para un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Uso de un ácido nucleico según la reivindicación 11 o de una pareja de cebadores específicos, a elegir del grupo definido por las SEQ ID Nos: 13-33, para fabricar un kit de diagnóstico in vitro para la infección por LVPR.

13. Uso de un ácido nucleico según la reivindicación 11 para fabricar una vacuna contra la infección por LVPR.

14. Anticuerpo que se une específicamente a un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15. Uso de un anticuerpo, según la reivindicación 14, para fabricar un kit de diagnóstico in vitro para la infección por LVPR.

16. Uso de un anticuerpo, según la reivindicación 14, para fabricar una vacuna contra la infección por LVPR.

17. Método para la detección in vitro de una infección por alguna estirpe Española del virus LVPR de los subtipos filogenéticos B2 artrítica, A pulmonar o A2

18. Método según la reivindicación 17 en que, opcionalmente, se emplea al menos un segundo anticuerpo capaz de unirse específicamente a un péptido comprendido en la composición peptídica según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

19. -Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18 caracterizado porque se emplea un anticuerpo capaz de unirse específicamente a un péptido codificado por un ácido nucleico según la reivindicación 11.

20. Método según cualquiera de las revindicaciones 17 a 19 caracterizado porque se emplea un anticuerpo según la reivindicación 14.

21. Kit para la detección de infección por LVPR que comprende al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones a 4, o un ácido nucleico según la reivindicación 11, o una pareja de cebadores, a elegir del

grupo definido por las SEQ ID Nos: 13-33, o un anticuerpo según la reivindicación 14.

22. Kit según la reivindicación 21 que comprende un soporte sólido. 10

23. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22 que, comprende una composición peptídica según las reivindicaciones 7 u 8.

LISTADO DE SECUENCIAS

<21 O> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido 98 correspondiente a una secuencia proteína ENV gp135 del virus Maedi-Visna

<400>

Val Asp Met Pro Gln Ser Tyr Ile Glu Lys Gln Lys Arg Asn 1 5 10

<21 O> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido 126 MI correspondiente a una secuencia proteína ENV gp135 del VAEC

<400>

Glu Leu Asp Cys Trp His Tyr His Gln Tyr Cys Val Thr Ser 1 5 10

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido 126 M2 correspondiente a una secuencia proteína ENV gp135 del virus Maedi-Visna

<400>

Glu Leu Asp Cys Trp His Tyr Gln His Tyr Cys Val Thr Ser 1 5 10

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido 139 correspondiente a una secuencia proteína ENV gp46 del virus Maedi-Visna

<400>

His Ile Ala Gln Arg Asp Ala Ser Arg Ile Pro Asp Val Trp 1 5 10

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido 140 correspondiente a una secuencia parcial de la proteína ENV gp46 del VAEC

<400>

Gln Leu Ala Gln Glu Gln Ala Arg Arg Ile Pro Asp Val Trp Glu 1 5 10 15

<210> 13

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'env-CAEV2 Fw Virus Maedi-Visna

<400>

atgggaatct ggataaatgg a 21

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5'Gag Cen LVPR Rv Virus Maedi-Visna

<400>

gctctrttyc caggcatcat 20

<210> 15

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'Wie5 Fw Virus Maedi-Visna

<400>

cttgtgtccg aggattttga 20

<210> 16

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5'Gag Fin LVPR Rv Virus Maedi-Visna

<400>

tcyccttcta taatcccycc tat 23

<210> 17

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'496 VRC Fw Virus Maedi-Visna

<400>

aagatgcaag catgcaggga c 21

<210> 18

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'Po1 1 Fw LVPR Virus Maedi-Visna

<400>

tggatgatat ytayataggr agtg 24

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5'Po1 11 Rv LVPR Virus Maedi-Visna

<400>

aaatcatayc cwgcatcttc 20

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'Po1 11 Fw LVPR Virus Maedi-Visna

<400>

ggacaagccc tatggatatw t 21

<210> 21

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5'TAT Rv LVPR Virus Maedi-Visna

<400>

ggttacatag yctrcahcca cad 23

<210> 22 <211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'5084 Fw Virus Maedi-Visna

<400>

caamgatggc thgcwatgc 19

<210> 23

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5'SU 1 LVPR Rv Virus Maedi-Visna

<400> 23 tctgtrcadg adacwgctyt tgc 23

<210> 24

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'SU 2 LVPR Fw Virus Maedi-Visna

<400> gcaggravma tmagrggaag att 23

<210> 25

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5' 567 Rv Virus Maedi-Visna

<400>

ccacatwgtt gtccaatthg tdtt 24

<210> 26

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'SU 3 LVPR Fw Virus Maedi-Visna

<400>

gatgyaaytg ywcamgrtca gg 22

<210> 27 <211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5'TM 1 LVPR Rv Virus Maedi-Visna

<400>

gcttcyacyc kagchactc 19

<210> 28

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'TM2 LVPR Fw Virus Maedi-Visna

<400>

trgchaaagg vrtamgmatc 20

<210> 29

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5' LTR LVPR Rv Virus Maedi-Visna

<400>

gcggttacat ttgctktgtc a 21

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3'LVPR Fw Virus Maedi-Visna

<400>

tggcctytmt ggcaaatgga 20

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

5. 3' 566 Fw Virus Maedi-Visna

<400>

gtragagctt ayacatatgg 20

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebado.

3. 5' TM3 LVPR Rv Virus Maedi-Visna

<400>

gcagckayta twgccatgat 20

<210> 33

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador TM4 LVPR F.

5. 3' Virus Maedi-Visna

<400>

cagwcycttg ctaaygcaac tg 22

SRLV ENV AA

LVI -1 (MI060S) KVI772 (L06906) KVl514 (M60610) EVl (551392) SA-OMVV (M31646) USA 85/34 (U64439) PlOLV (AF479638) 593 SHEEP (AF338226) SWISS GOAT (AY445885)

CAEV-CO (M33677)

CAE.

7. G63 (M60855) CAEV-IGA (AF322109) CAEV-GANSU (AY900630) CAEV-680 GOAT (AJ400718) CAEV-786 GOAT (AJ4007211

r

98M

VDMPQSYIEKQKRNK

640 650 660 670 680

i.D~~QQ;.¡, i.Q ;'Q~iR.m.;'T;'GM· Q~~ER~E~RR~:!, ;.;, i.Q!KRR

. ... ... . ........ .............~...K.. -........ . ..............................AQ.K .... -, ....... .

.. 1 .........E .0 ....L. ---K ...N-AFKKE ... .

VlI

. G .....V. ....R.........0. KA.R.KNMR.K ..TEISRP ... . . G .... 1 .... R........... K.... SQKRKK ..TELQ.K.R .. . G ..............0. KA.S---EKKK.Q-PQS ...R.. ....R........... K....RQKRKK ..AELQ . K ... .

tI

• G ....V . .. .. K .. .. •.. •.0.•.• IQNQEKYKK. -K.S ..•R..

.. G L ... 1 .. '['" .R ........ 1.. EN.AKT.II .. KKRELSHK ... . .. G L ... !. ......R........ L . EN . AKT . II ... KRELSHT ... .

I.G V... 1., . . ............ 10. ON.ETLP.RR .. D--LAKA ... . .. G L ... 1. ......K........ 1.. EN.AKT.II ... KRELSHT ... .

•• G .... 1. . t....K ...... 1. . KN. EQIN---LKKRDLSHK ... . .• G .... 1...............MI .. KN. EQISRN-.. KRDLSHK ... .

I I I V4 V5 Val as

Figura 1